荷花液泡膜型Na+-H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NnNHX1的克隆及轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性的初步分析.pdf

1、鹽脅迫嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，而液泡膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以將多余的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)并區(qū)隔化于液泡中，在植物耐鹽性方面起著重要的作用。
　　 本研究以‘冬荷’為材料，通過設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用RT-PCR和RACE等技術(shù)克隆到了一個(gè)液泡膜型N+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，命名為NnNHX1。序列分析顯示，該基因全長(zhǎng)為2237 bp，5’和3’非編碼區(qū)分別長(zhǎng)426bp和194bp，開放閱讀框?yàn)?617bp。疏水性和跨膜分析顯示NnNH

2、X1蛋白的N-端高度疏水并含有11個(gè)跨膜區(qū)域，C-端是一個(gè)親水的尾巴。對(duì)NnNHX1的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)表明，NnNHX1與葡萄、水稻、擬南芥等的液泡膜型N+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源性較高，并且都具有高度保守的氨氯吡嗪咪結(jié)合位點(diǎn)序列LFFIYLLPPI。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明NnNHX1與液胞膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白關(guān)系較近，而與質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白關(guān)系較遠(yuǎn)。構(gòu)建了NnNHX1基因的植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1301-220

3、-NnNHX1，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草，經(jīng)共培養(yǎng)、繼代篩選與生根篩選后，共獲得14個(gè)抗性植株，經(jīng)PCR檢測(cè)后，確定其中7株抗性苗為轉(zhuǎn)基因株系，分別命名為T-N1～T-N5、T-N9和T-N10。根據(jù)NHX1基因的保守序列和NnNHX1基因的特異序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行熒光定量PCR，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因株系T-N1、T-N2和T-N10中NnNHX1和總NHX1表達(dá)量與對(duì)照相比均較高。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草組培苗進(jìn)行鹽脅迫表明，當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl濃

4、度為100 mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)基因與對(duì)照植株均能生根，但轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)情況好于對(duì)照；當(dāng)NaCl濃度為200mmol/L時(shí)，對(duì)照植株無法正常生根，葉片與莖都發(fā)生黃化，瀕臨死亡，而轉(zhuǎn)基因植株仍可緩慢生長(zhǎng)。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草盆栽苗進(jìn)行鹽脅迫并測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)，結(jié)果表明，正常情況下，對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系葉片的各個(gè)生理指標(biāo)大致相同，而經(jīng)鹽脅迫處理后，各植株葉綠素含量都明顯降低，但轉(zhuǎn)基因株系下降的幅度小于對(duì)照；丙二醛含量和相對(duì)電導(dǎo)率均有所上升，且對(duì)照植株的值