白刺液泡膜Na+-H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆及特性分析.pdf

1、白刺屬(NitrariaL.)是蒺藜科（Zygophyllaceae）的古老小屬，該屬植物是我國(guó)內(nèi)蒙古、甘肅和新疆一帶荒漠植被的重要建群種之一，為耐干旱、耐鹽堿、抗風(fēng)蝕沙埋、生長(zhǎng)快、易繁殖的優(yōu)良防風(fēng)固沙先鋒植物，具有很高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。因此開(kāi)發(fā)其抗逆性基因資源、從分子生物學(xué)角度探討其耐鹽機(jī)理具有重要的理論意義。
　　液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na+/H+exchangerorantipoter,NHX)在植物耐鹽性中起著重要

2、作用，NHX能將胞質(zhì)中過(guò)多的Na+逆濃度梯度運(yùn)入液泡內(nèi)積累，這不僅降低了Na+對(duì)細(xì)胞的毒害，還可以有效利用儲(chǔ)存在液泡中的Na+作為滲透調(diào)節(jié)劑。
　　本研究采用RT-PCR及RACE技術(shù)獲得白刺N(yùn)a+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（NsNHX1）的cDNA全長(zhǎng)序列，該基因全長(zhǎng)2182bp，包含一個(gè)1635bp的開(kāi)放閱讀框，編碼544個(gè)氨基酸，5'非編碼區(qū)148bp，3'非編碼區(qū)399bp，蛋白分子量59.9kDa。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示白刺N(yùn)a+

3、/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與葡萄柚（無(wú)患子目，蕓香科）及霸王（蒺藜目，蒺藜科）Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白親緣關(guān)系較為接近。
　　半定量RT-PCR結(jié)果顯示NsNHX1基因在白刺葉中的表達(dá)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于莖和根，NsNHX1基因的表達(dá)受外源ABA、低溫及NaCl的誘導(dǎo)，15％PEG處理下，其表達(dá)量變化不顯著。這與我們利用TAIL-PCR克隆的807bpNsNHX15'端上游調(diào)控序列中發(fā)現(xiàn)的與鹽、冷、ABA誘導(dǎo)作用相關(guān)的順式作用元件的結(jié)果一致。So

4、uthern雜交結(jié)果顯示NsNHX在白刺基因組中有2-3個(gè)拷貝。洋蔥表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化NsNHX1-GFP融合蛋白的瞬時(shí)表達(dá)顯示，GFP信號(hào)僅出現(xiàn)在液泡膜的位置，推測(cè)NsNHX1定位于細(xì)胞液泡膜上。
　　為分析NsNHX1的異源表達(dá)特性，我們利用花序浸染法獲得了轉(zhuǎn)NsNHX1擬南芥，通過(guò)篩選獲得T3代轉(zhuǎn)基因植株純合系，耐鹽性實(shí)驗(yàn)分析顯示，在鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子發(fā)芽率、根生長(zhǎng)量及幼苗長(zhǎng)勢(shì)與野生型擬南芥相比具有一定的優(yōu)勢(shì)，顯示了NsN