菊花及其近緣種屬植物質(zhì)膜Na+-H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SOS1s基因克隆與功能鑒定.pdf

1、菊花(Chrysanthemum morifolium)是我國十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一，用途和栽培地域極廣，觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高，在花卉生產(chǎn)中占有十分重要的地位。鹽脅迫嚴(yán)重影響植物的生長和發(fā)育，在切花菊設(shè)施栽培中土壤次生鹽漬化及我國大面積鹽漬土是制約菊花生產(chǎn)與園林應(yīng)用的主要因子;菊花及其近緣種屬植物資源豐富，耐鹽性差異很大。對耐鹽性差異的菊花及其近緣種屬植物耐鹽機(jī)理研究及耐鹽優(yōu)異基因挖掘是加快培育耐鹽菊花新品種的基礎(chǔ)。此外，菊花是淺

2、根觀賞花卉，忌水濕，夏季田間積澇會(huì)導(dǎo)致其大面積死亡;澇與鹽協(xié)同脅迫對菊花生長產(chǎn)生的傷害更大，因此有必要對兩者協(xié)同脅迫的機(jī)制進(jìn)行研究。本文研究的主要內(nèi)容與結(jié)論如下:
　　1.對菊花‘神馬’及其3種近緣種屬植物（牡蒿、芙蓉菊和大島野路菊）苗期進(jìn)行200 mM NaCl處理，分別從形態(tài)和根、莖、葉各部位Na含量兩個(gè)方面評(píng)價(jià)4種植物的耐鹽性。結(jié)果表明，NaCl處理第7d時(shí)，‘神馬’葉片首先表現(xiàn)萎蔫和黃化，大島野路菊葉片在NaC1處理第10

3、d時(shí)表現(xiàn)出相似的癥狀，而芙蓉菊和牡蒿葉片在第14d時(shí)依舊沒有明顯傷害;且經(jīng)NaC1脅迫后，4種植物各部位Na+含量均顯著增加，芙蓉菊和牡蒿增加量最少，大島野路菊次之，‘神馬’增加量最多。以上結(jié)果表明，芙蓉菊和牡蒿耐鹽性極強(qiáng)，大島野路菊耐鹽性強(qiáng)，‘神馬’為鹽敏感植物;且NaCl脅迫后，鹽敏感材料中Na+增加量多于耐鹽材料。
　　2.質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SOS1是植物受到高鹽脅迫的第一道屏障，也是植物長期耐鹽脅迫的有效機(jī)制。

4、為了明確菊花及其3種近緣種屬植物離子穩(wěn)態(tài)及耐鹽性差異的分子機(jī)制，分別克隆其質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SOS1s基因，各自命名為AjSOS1、CrcSOS1、CcSOS1和CmSOS1。序列分析發(fā)現(xiàn)，AjSOS1和CrcSOS1均編碼1147個(gè)氨基酸，CcSOS1和CmSOS1均編碼1145個(gè)氨基酸。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明4個(gè)SOS1s蛋白N端具有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，C端具有約700個(gè)氨基酸殘基的親水胞質(zhì)長尾。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)4個(gè)SOS1s蛋

5、白與已知植物質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源性很高，達(dá)90.32％-94.68％。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，4個(gè)SOS1s和菊芋HtSOS1及番茄S1SOS1親緣關(guān)系最近。時(shí)空表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，鹽處理均誘導(dǎo)4個(gè)SOS1s基因表達(dá)上調(diào)，AjSOS1和CrcSOS1轉(zhuǎn)錄水平較高。
　　3.將4個(gè)SOS1s基因?qū)胭|(zhì)膜Na+泵ATPase ENA1-4和質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體NHA1均缺失的酵母突變體ANT3。結(jié)果表明:4個(gè)SOS1s均能回

6、補(bǔ)ANT3突變體對Na+的轉(zhuǎn)運(yùn)功能;在含70 mM NaCl的AP培養(yǎng)基上，酵母細(xì)胞表達(dá)AjSOS1長勢最好，CrcSOS1次乏，CcSOS1長勢弱于CrcSOS1，強(qiáng)于CmSOS1，而CmSOS1長勢最差。為了進(jìn)一步明確4個(gè)SOS1s基因回補(bǔ)能力差異的原因，在比較AjSOS1和CmSOS1氨基酸序列差異基礎(chǔ)上，采用定點(diǎn)突變技術(shù)產(chǎn)生一系列AjSOS1muts。通過其對酵母突變體ANT3的回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)一些可能影響AjSOS1活性的重要關(guān)

7、鍵氨基酸位點(diǎn)，例如:位于N端跨膜區(qū)的G13E、T26S、F143I和V238L及位于C端胞質(zhì)尾區(qū)的Y463H、Y549H、S639L、A919T、YG927HS、G982V、A1027V、N1109K和G1127A等。
　　4.構(gòu)建4個(gè)SOS1s基因植物遺傳轉(zhuǎn)化表達(dá)載體pMDC32-SOS1s，分別采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法和擬南芥花粉管侵染法將4種載體轉(zhuǎn)入鹽敏感材料‘神馬’、擬南芥野生型gl1和突變體sos1-1，獲得超表達(dá)株系。鹽

8、處理轉(zhuǎn)基因菊花株系發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)SOS1s基因能減少植株體內(nèi)Na+含量積累和增加K+含量，提高K+/Na+，增強(qiáng)植株的耐鹽性。此外，在含鹽培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)率和植株根長、鮮重均高于對應(yīng)的擬南芥對照。總之，通過對超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系鹽處理發(fā)現(xiàn)，來自耐鹽植物中的SOS1s比從鹽敏感植物中分離的，OS1s有較強(qiáng)的耐鹽性。
　　5.構(gòu)建pBIG-CmSOS1-overexpress、antisense和amiRNAi表達(dá)載體，通過農(nóng)桿

9、菌介導(dǎo)的葉盤法進(jìn)行同源遺傳轉(zhuǎn)化‘神馬’。鹽和淹水協(xié)同脅迫14 d后，轉(zhuǎn)基因株系中正義株系的存活率（49％-51％）顯著高于轉(zhuǎn)空載株系(31％)，而反義和人工干擾株系的存活率顯著低于轉(zhuǎn)空載株系，僅為20％-22％,表明超表達(dá)CmSOS1提高了轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽和耐澇性;反義和干擾CmSOS1均降低了轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽和耐澇性。此外，脅迫條件下，正義株系葉片中相對電導(dǎo)率、MDA及H2O2和O2-含量均低于轉(zhuǎn)空載株系，而可溶性蛋白含量及SOD和C