檉柳液泡膜H+-ATPasec-亞基(ThVHAc-1)基因面耐鹽功能分析.pdf

1、植物液泡膜H+-ATPase(V-ATPase)是一個(gè)多亞基復(fù)合蛋白，在植物中最基本的功能是維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的酸堿性內(nèi)平衡狀態(tài)（pH值內(nèi)穩(wěn)態(tài)）和建立跨膜電化學(xué)梯度、為相關(guān)的代謝提供能量。當(dāng)植物處于逆境條件下，V-ATPase在調(diào)控植物響應(yīng)逆境過程的功能具有復(fù)雜性和多樣性。對(duì)V-ATPase全酶功能的了解可以通過其關(guān)鍵亞基的深入研究來(lái)實(shí)現(xiàn)，有研究報(bào)道了其中的a、c、G等亞基的抗逆功能。但鮮有關(guān)于c"亞基的抗逆功能研究的報(bào)道。本研究對(duì)檉柳V-A

2、TPase c"亞基基因的表達(dá)和抗逆功能進(jìn)行了初步分析，獲得的結(jié)果如下:
　　對(duì)0.4mol/L NaCl,20％ PEG,0.3 mol/L NaHCO3,150μmol/L CdCl2和100μmol/LABA處理后剛毛檉柳根、莖、葉中Th VHAc"1基因的表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示該基因能對(duì)這些脅迫做出響應(yīng)，在脅迫后檉柳各組織中主要表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，在NaCl脅迫24h的葉中表達(dá)被誘導(dǎo)了8.88倍。
　　在前期研究中已經(jīng)

3、證實(shí)ThVHAc1基因能明顯提高植物的抗逆能力，為了分析ThVHAc"1基因是否也具有抗逆功能，將ThVHAc"1基因轉(zhuǎn)入酵母中，使其在酵母中表達(dá)，分析比較了轉(zhuǎn)基因和對(duì)照酵母在各種逆境脅迫后的存活率，結(jié)果顯示，與對(duì)照酵母相比，轉(zhuǎn)ThVHAc"1基因酵母能提高抵抗鹽、過氧化物、重金屬、異常溫度和干旱等脅迫的能力。推測(cè)ThVHAc"1基因也能參與多種逆境脅迫抗性過程。
　　為了進(jìn)一步分析ThVHAc"1基因在植物中的抗逆功能，構(gòu)建了T

4、hVHAc"1基因植物過表達(dá)載體35S∷ThVHAc"1，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘸花法將重組載體轉(zhuǎn)入擬南芥，對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥中的ThVHAc"1基因表達(dá)進(jìn)行分析，確認(rèn)其確實(shí)過表達(dá)。對(duì)T3代轉(zhuǎn)基因苗進(jìn)行脅迫處理。分析比較脅迫前后轉(zhuǎn)基因和對(duì)照擬南芥發(fā)芽、生長(zhǎng)和相關(guān)抗逆生理指標(biāo)。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)ThVHAc"1基因擬南芥在鹽脅迫下的發(fā)芽率和生物量積累明顯優(yōu)于對(duì)照。組織化學(xué)染色(DAB、H2DCF、Evans Blue)結(jié)果顯示，鹽脅迫下，過表達(dá)ThVHAc

5、"1基因擬南芥積累的活性氧(ROS)明顯少于野生型(WT)，所受到的細(xì)胞損傷也比WT輕。此外，非脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因株系的保護(hù)酶活性、電導(dǎo)率、MDA含量等無(wú)明顯差異，但NaCl脅迫后，ThVHAc"1轉(zhuǎn)基因株系的SOD、POD、GST活性顯著高于WT，而H2O2含量、MDA含量及相對(duì)電導(dǎo)率卻顯著低于WT。這些結(jié)果表明，過表達(dá)ThVHAc"1明顯提高了轉(zhuǎn)ThVHAc"1基因擬南芥的耐鹽能力。
　　為了驗(yàn)證ThVHAc"1基因

6、在擬南芥中異源表達(dá)的結(jié)果，將ThVHAc"1在檉柳中進(jìn)行了瞬時(shí)過表達(dá)和抑制表達(dá)，比較瞬時(shí)過表達(dá)、抑制表達(dá)ThVHAc"1基因檉柳和對(duì)照檉柳在鹽脅迫前后的表現(xiàn)。結(jié)果顯示，鹽脅迫下過表達(dá)ThVHAc"1基因的檉柳的保護(hù)酶活性明顯高于pROKⅡ株系，而抑制表達(dá)株系的保護(hù)酶活性明顯低于pROKⅡ株系;同時(shí)，過表達(dá)株系的ROS水平和細(xì)胞受損傷程度明顯少于或弱于pROKⅡ株系，而抑制表達(dá)株系卻明顯高于pROKⅡ株系。
　　此外，為進(jìn)一步分析T

7、hVHAc"1基因耐鹽調(diào)控的上游機(jī)制，利用染色體步移法克隆獲得了ThVHAc"1上游1033 bp啟動(dòng)子序列。利用PLACE在線分析軟件對(duì)ThVHAc"1上游啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子含有G-box、TATA-box、CAAT-box、W-box等多個(gè)脅迫應(yīng)答元件。利用酵母單雜交技術(shù)篩選獲得可特異識(shí)別ThVHAc"1基因啟動(dòng)子中的DOF元件的上游調(diào)控基因ThDof8。初步證實(shí)ThDof8可能參與調(diào)控或者共同與ThVHAc"1來(lái)完成