杜氏鹽藻DsPLC基因的功能分析.pdf

1、杜氏鹽藻（Dunaliella salina以下簡(jiǎn)稱鹽藻）是已知最為耐鹽的真核生物之一，但到目前為止，其耐鹽的分子機(jī)制及應(yīng)答鹽脅迫信號(hào)的分子途徑還不清楚。磷脂酶C（phospholipase C，簡(jiǎn)稱PLC）能夠水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2），產(chǎn)生兩個(gè)重要的第二信使。磷脂酰肌醇信號(hào)通路廣泛參與生物體內(nèi)多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，磷脂酶 C是該信號(hào)途徑中的關(guān)鍵酶，因此，深入探討鹽藻磷脂酶C的生物學(xué)特性及作用機(jī)制，對(duì)于闡明鹽藻應(yīng)答鹽脅

2、迫信號(hào)的分子途徑具有重要科學(xué)意義。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增了DsPLC的開放閱讀框序列，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGS21a-DsPLC，將該重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)成功表達(dá)了融合蛋白，通過SDS-PAGE檢測(cè)，在上清和包涵體中都有融合蛋白的存在?？扇苄缘鞍捉?jīng)過GST純化柱純化，結(jié)果表明，在96 KD左右有單一的蛋白條帶，說明融合蛋白得到有效純化。蛋白印跡結(jié)果顯示在96

3、 KD左右有明顯的雜交條帶，初步證明純化的蛋白就是帶有GST標(biāo)簽的磷脂酶C蛋白。⑵將鹽藻DsPLC開放閱讀框序列連接到帶有綠色熒光蛋白基因的亞細(xì)胞定位表達(dá)載體pMDCG上，成功構(gòu)建了亞細(xì)胞定位表達(dá)載體pMDCG-DsPLC，通過凍融法將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將表達(dá)載體導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞，使DsPLC在洋蔥表皮細(xì)胞中成功表達(dá)，明確了鹽藻磷脂酶C主要分布在細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)中。⑶將杜氏鹽藻DsPLC基因的開放閱讀框與酵母雙雜交誘餌表達(dá)載體p