鹽生杜氏藻（6-4）光裂合酶基因在Pichia pastoris中的表達(dá)和功能研究.pdf

1、鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)是一種單細(xì)胞真核綠藻,它不僅能在高鹽環(huán)境中生存,而且具有較強(qiáng)的抗紫外特性.該文在已克隆到鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因(Ds64PHR)的基礎(chǔ)上,應(yīng)用巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris,Pp)重組蛋白表達(dá)系統(tǒng),將Ds64PHR導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母中進(jìn)行高效的表達(dá),并對該基因在真核生物中抗紫外功能進(jìn)行初步驗(yàn)證.取得的主要研究結(jié)果如下:1.首先采用高壓電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞,通過正

2、交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化影響Pichiapastoris轉(zhuǎn)化效率畢赤酵母的轉(zhuǎn)化條件參數(shù),包括電擊電壓,制備感受態(tài)的細(xì)胞培養(yǎng)濃度,質(zhì)粒DNA的濃度,擔(dān)體DNA的加入,電擊后的復(fù)蘇等.初步得出電擊電壓1500V,培養(yǎng)細(xì)胞濃度OD<,600>=1.3時,質(zhì)粒濃度100ng/μ L,總量500ng-1μ g時轉(zhuǎn)化率最高.且在加有擔(dān)體DNA時及電擊后進(jìn)行復(fù)蘇時能較大的提高其電轉(zhuǎn)化效率;2.構(gòu)建了能在Pichia pastoris的高效表達(dá)的重組型的表達(dá)載體pG

3、APZB-Ds64PHR并進(jìn)行了分子生物學(xué)驗(yàn)證;3.將表達(dá)載體pGAPZB-Ds64PHR重組到Pichia pastoris基因組DNA中,構(gòu)建GS115-Ds64PHR工程菌并進(jìn)行了分子生物學(xué)驗(yàn)證.4.應(yīng)用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析工程菌GS115-Ds64PHR表達(dá)外源蛋白Ds64PHR的能力及Ds64PHR表達(dá)水平與抗紫外能力的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)它們之間并不是正相關(guān)的關(guān)系.還證明Pichiapastori