小麥胚乳特異性多酚氧化酶基因RNA干擾載體的構建及遺傳轉化.pdf

1、面粉中的多酚氧化酶是造成面團褐變的主要因素之一，通過轉基因技術阻斷或降低ppo基因的表達，對于提高面制品的白度，具有重要意義。而探索和建立具有取材方便、無受體基因型限制、簡單高效的農(nóng)桿菌轉化體系，是實現(xiàn)小麥轉基因技術突破的關鍵。本論文包含兩部分研究內容：一是高效農(nóng)桿菌轉化體系的建立；二是構建小麥胚乳特異表達的多酚氧化酶(polyphenol oxidase，ppo)基因的RNA干擾載體，并利用農(nóng)桿菌介導技術將其轉入普通小麥。
　　

2、 1.高效農(nóng)桿菌轉化體系的建立 使用取材方便的成熟胚作為轉化受體，操作方法簡單，不經(jīng)過愈傷組織的過程，實驗周期短，且陽性率高。注射轉化法轉化小麥總陽性率為78.1％，穗部陽性率為73.2％；針刺轉化法轉化小麥總陽性率為59.8％，穗部陽性率為51.9％。K35使用針刺法和注射法轉化總陽性率74.2％，穗部陽性率為53.6％；濟引1號分別使用針刺法和注射法進行轉化總陽性率65.7％，穗部陽性率為76.9％。未萌動時轉化陽性率為67.7％

3、，穗部陽性率為63.6％；籽粒萌動時轉化陽性率為69.7％，穗部陽性率為65.2％；有芽時轉化陽性率為72.1％，穗部陽性率為65.9％。所以使用濟引1號為轉化受體，在籽粒有芽時采用注射法轉化效果更好。
　　 2.載體構建 本研究選用ppo基因的第三外顯子為靶序列，goujianle含有胚乳特異性啟動子Bx17和ppo基因的特異性RNA干擾表達盒的中間載體pZlbx-ppoRNAi。通過選用合適的酶切位點，酶切連接構建得到中間載

4、體pBluippo和pBluippopBIOS，然后將pBluippopBIOS中含Bx17和ppo基因的RNA干擾表達盒整合到含Ac/Ds轉座子系統(tǒng)的pBIOS1952載體上，構建得到能有效去除篩選標記基因的ppo特異性干擾的農(nóng)桿菌表達載體piPPO。
　　 3.piPPO農(nóng)桿菌載體轉化小麥 將含有piPPO載體的農(nóng)桿菌利用農(nóng)桿菌介導方法對500個正在生長中的幼胚進行轉化，在幼胚和胚乳間緊密接觸處注入piPPO農(nóng)桿菌菌液，經(jīng)過