牛X-、Y-精子消減Cdna文庫的篩選及差異表達(dá)基因的分析.pdf

1、雄性哺乳動物可同時產(chǎn)生X-、Y-精子,研究兩種精子的轉(zhuǎn)錄本對于揭示精子發(fā)育過程中的基因表達(dá)具有重要理論意義,同時在家畜性別控制技術(shù)研究中也具有重要的地位。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為,相鄰精子的基因表達(dá)產(chǎn)物通過細(xì)胞間橋被共享,檢測兩種性別精子的表達(dá)差異已沒有意義,然而目前沒有證據(jù)表明細(xì)胞間橋使所有的表達(dá)產(chǎn)物共享。為研究X-、Y-精子間基因表達(dá)差異情況,本實驗室前期構(gòu)建了牛X-、Y-消減cDNA文庫。本研究采用芯片技術(shù)與序列同源性分析相結(jié)合的方法對文庫中

2、的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選和分析,并通過real-time RT-PCR方法驗證了芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性。
　　 1.牛X-、Y-精子消減cDNA的篩選
　　 采用cDNA芯片技術(shù)對已構(gòu)建的牛X-、Y-精子消減cDNA文庫進(jìn)行篩選。根據(jù)文庫的序列中信息,選取201個代表所有unigenes clones的PCR純化產(chǎn)物點制了cDNA芯片；分別制備X-、Y-精子總RNA,并進(jìn)行兩輪mRNA線性擴增,將得到的aRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,

3、再對cDNA進(jìn)行熒光標(biāo)記；將cDNA芯片與標(biāo)記的cDNA雜交。采用SAM軟件分析3張生物學(xué)重復(fù)芯片的數(shù)據(jù),獲得31個陽性差異表達(dá)clones,即陽性差異表達(dá)unigenes,其中4個在Y-精子中上調(diào),27個在X-精子中上調(diào)。
　　 2.差異表達(dá)基因的序列同源性分析
　　 對經(jīng)過芯片雜交驗證的陽性差異表達(dá)基因的Blastx比對結(jié)果顯示,有12.9％的unigenes(4個contigs)與SwissProt數(shù)據(jù)庫中注釋的蛋

4、白質(zhì)高度同源(E-value≤1×10-10),其中1個基因在Y-精子中上調(diào),3個基因在X-精子中上調(diào),并且這4個基因都與精子的基礎(chǔ)生命活動相關(guān)。對剩余差異表達(dá)基因的Blastn比對結(jié)果顯示,32.26％的unigenes(7個contigs和3個singlets)與牛EST數(shù)據(jù)庫中的序列高度同源(E-value≤1×10-10),認(rèn)為是未知功能的基因,其中1個基因在Y-精子中上調(diào),9個基因在X-精子中上調(diào)。其余54.84％的unige

5、nes在數(shù)據(jù)庫中未找到同源序列(E-value≥1×10-10),認(rèn)為可能是新基因。
　　 3.Real-time RT-PCR對兩個基因表達(dá)情況的檢測
　　 對陽性差異表達(dá)基因細(xì)胞色素b基因(Cytochrome b,CYTB)和鐵硫簇支架蛋白基因(Iron-sulfur cluster scaffold.ISCU)在X-、Y-精子中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示兩個基因在X-精子中的表達(dá)量分別是在Y-精子中的1.731