陸地棉纖維次生壁加厚期正向消減文庫的構(gòu)建及差異表達(dá)基因分析.pdf

1、棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，也是紡織工業(yè)中天然纖維的主要來源。此外，棉纖維細(xì)胞也是研究植物細(xì)胞伸長、纖維素合成和次生壁發(fā)育的理想模式材料。近年來，伴隨著各種高通量研究策略的使用，棉纖維發(fā)育的遺傳機(jī)理得到了更深層次的研究，并取得了一系列重要的研究成果。然而，大部分研究主要集中在纖維發(fā)育的起始和伸長階段，對(duì)次生壁加厚期的研究還相對(duì)較少，極大地限制了利用基因工程手段改良棉纖維比強(qiáng)度這一重要纖維品質(zhì)性狀的步伐。因此，有必要針對(duì)棉纖維次生壁加厚期的遺傳

2、機(jī)理開展進(jìn)一步的研究，為棉花分子育種提供更多可利用的基因資源。
　　 本研究以陸地棉高斷裂比強(qiáng)度材料0-153和轉(zhuǎn)基因抗蟲棉sGK9708為親本構(gòu)建的高代重組自交系群體(F6:9)中選育出的高比強(qiáng)度纖維品系(H，69307)作為研究材料，利用抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)，構(gòu)建了陸地棉纖維次生壁加厚期的正向消減cDNA文庫，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。本研究結(jié)果如下：
　　 1、本研究以H15DPA纖維為driver、H20

3、DPA纖維為tester，成功構(gòu)建出陸地棉纖維次生壁加厚期的正向消減cDNA文庫。該文庫共包含1152個(gè)陽性克隆，重組率為97.04%，滴度為1.89×104cfu/ml。
　　 2、對(duì)挑選的1152個(gè)陽性克隆進(jìn)行反向Northern篩選，共得到340個(gè)差異表達(dá)克隆，代表115個(gè)非冗余基因，其中包含35個(gè)重疊群，80個(gè)單拷貝。生物信息學(xué)分析表明，這些差異表達(dá)基因廣泛參與了糖類、脂類、氨基酸等物質(zhì)的代謝，以及纖維素生物合成、細(xì)胞壁

4、合成與修飾、氧化還原、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程。
　　 3、從115個(gè)差異表達(dá)基因中選取18個(gè)代表性基因，利用熒光定量PCR進(jìn)行表達(dá)模式分析。結(jié)果表明，所挑選的基因在H20DPA纖維中的表達(dá)水平均明顯高于其在H15DPA纖維中的表達(dá)水平，說明消減文庫的結(jié)果真實(shí)，可靠。同時(shí)，也暗示這些基因可能與棉纖維的次生壁加厚相關(guān)。上述18個(gè)基因包括水通道蛋白、阿拉伯半乳糖蛋白4、類受體蛋白激酶、類成束蛋白阿拉伯半乳糖蛋白1、類成束蛋白阿拉伯半

5、乳糖蛋白16、類幾丁質(zhì)酶蛋白1、FbLate-2、纖維素合成酶1、纖維素合成酶2、果膠甲酯酶5、細(xì)胞色素C氧化還原酶，Cobra-like4蛋白、NADH脫氫酶亞基、植物類糖原淀粉起始蛋白3、分泌載體膜蛋白、功能未知基因1-A10、功能未知基因3-E3、功能未知基因10-F6。
　　 4、利用簡單序列重復(fù)識(shí)別工具SSRIT對(duì)115條EST序列進(jìn)行簡單序列重復(fù)(SSR)位點(diǎn)的篩選，共得到16條含有SSR位點(diǎn)的序列，并設(shè)計(jì)了16對(duì)S