申克孢子絲菌酵母相和菌絲相cDNA消減文庫的構(gòu)建及差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析.pdf

1、申克孢子絲菌（Sporothrix Schenckii，SSchenckii）是孢子絲菌?。⊿porotrichosis）的病原菌，該菌遍布世界各地，人類可因皮膚輕微外傷后接觸被該菌污染的物質(zhì)而感染。由申克孢子絲菌引起的孢子絲菌病是最常見的深部真菌感染之一，在全世界均有發(fā)生。臨床表現(xiàn)為皮膚、皮下組織及其附近淋巴系統(tǒng)的慢性感染，皮損多局限于暴露部位，形成沿淋巴走行分布的特征性結(jié)節(jié)，可引起皮膚化膿、潰爛及滲出，少數(shù)病人可發(fā)生多系統(tǒng)播散。

2、r>　　 申克孢子絲菌為一種雙相型真菌，在室溫25℃表現(xiàn)為菌絲相，體內(nèi)37℃為酵母相，這種酵母相與菌絲相之間的轉(zhuǎn)換稱為菌相轉(zhuǎn)換。申克孢子絲菌酵母相可在感染者體內(nèi)組織增殖，形成小的芽生孢子而致病。
　　 申克孢子絲菌的雙相性表明該菌不同菌相存在差異表達(dá)基因，在不同的環(huán)境條件下，通過菌體內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控，表現(xiàn)為酵母相或菌絲相。目前申克孢子絲菌雙相轉(zhuǎn)換的相關(guān)研究僅涉及少數(shù)幾個基因，雙相轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制尚未明了，研究申克孢子絲菌雙相轉(zhuǎn)換

3、機(jī)制對揭示其發(fā)病機(jī)理有重要意義。
　　 本研究應(yīng)用抑制性消減雜交（Suppression SubtractiveHvbridization，SSH）技術(shù)，構(gòu)建高特異性的申克孢子絲菌菌絲相（Mycelium，M）和酵母相（Yeast，Y）的正反cDNA消減文庫，并對其差異表達(dá)的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以探討差異表達(dá)基因與酵母相與菌絲相雙相轉(zhuǎn)換的相關(guān)性。
　　 本研究選擇申克孢子絲菌標(biāo)準(zhǔn)株CMCC（F）D1a作為研究對象，以

4、體外誘導(dǎo)形成的純的菌絲相（M）與酵母相（Y）細(xì)胞作為實驗材料，分別提取M與Y細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增M與Y細(xì)胞的cDNA，純化擴(kuò)增的cDNA，經(jīng)RsaI酶切處理，將酶切后的M與Y細(xì)胞的cDNA分別作為測試子（Testa）和驅(qū)動子（driver），將M與Y細(xì)胞的cDNA分別分為兩份，每份連接不同的接頭，即：接頭1（adaptorl）和接頭2（adaptor2）。之后進(jìn)行兩輪消減雜交及兩輪PCR擴(kuò)增，純化第二輪PCR產(chǎn)物，以紫外分光光度

5、計檢測cDNA純度與濃度。連接載體pGEM-T并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞TOPO10，藍(lán)白斑篩選陽性克隆，采用T7引物，PCR擴(kuò)增插入片段，挑取插入片斷大于250bp、帶型單一的克隆進(jìn)行大規(guī)模測序。判別測序的有效性，去除非單一克隆的數(shù)據(jù)，并對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行去載、拼接、聚類和Blastn分析及整理。
　　 結(jié)果：M+Y文庫（即在M相高表達(dá)，Y相低表達(dá)或不表達(dá)）獲得751條表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed SequenceTags，ESTs），

6、平均長度為690.98bp，ESTs經(jīng)拼接后獲得101條unigenes；Y+M文庫（即在Y相高表達(dá)，M相低表達(dá)或不表達(dá)）獲得875條ESTs，平均長度為575.9bp，拼接獲得249條tmigenes。Blastn分析發(fā)現(xiàn)兩個消減文庫中都出現(xiàn)多個重復(fù)的基因序列，去除重復(fù)序列后，M+Y文庫共獲得45條unigenes，Y+M文庫獲得91條unigenes。申克孢子絲菌酵母相菌絲相的轉(zhuǎn)換伴隨著不同菌相細(xì)胞差異基因的高表達(dá)，這些高表達(dá)的差異

7、基因可分為四類：（1）結(jié)構(gòu)基因類，如18S、25sRNA基因，AJ496242.1，F(xiàn)J882050.1，AF343676.1等，某些結(jié)構(gòu)基因在申克孢子絲菌酵母相菌絲相狀態(tài)下的獨特表達(dá)，可能是菌相轉(zhuǎn)換的結(jié)果；（2）代謝酶類，如gb｜CP001656.1｜，ref｜NM_001006571.1｜，DQ298384.1等，參與碳水化合物、氨基酸、脂質(zhì)和輔酶運輸和代謝；（3）細(xì)胞表面分子類，如gi｜30721613｜，gi｜45383668，

8、gb｜GQ379464.1｜等，這些分子參與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，推測其在菌相轉(zhuǎn)換中起介導(dǎo)細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控或細(xì)胞行為的改變；（4）功能不明的細(xì)胞分子，如gb｜DQ510714.1｜，gb｜EU923089.1｜，gb｜DQ298391.1｜等。它們在申克孢子絲菌雙相轉(zhuǎn)換機(jī)制中的作用也有待進(jìn)一步驗證。
　　 申克孢子絲菌菌絲相和酵母相cDNA消減文庫的構(gòu)建及生物信息學(xué)分析為進(jìn)一步篩選鑒定菌相轉(zhuǎn)換相關(guān)差異基因奠定了基礎(chǔ)，有助于闡明申克