申克孢子絲菌菌株的核型分析及Sir2基因表達(dá)水平的研究.pdf

1、孢子絲菌病因臨床表現(xiàn)的不同可分為皮膚固定型、皮膚淋巴管型以及播散性孢子絲菌病。近年研究認(rèn)為孢子絲菌病的臨床表現(xiàn)與宿主的免疫狀態(tài)和菌株的毒力均相關(guān)。孢子絲菌25℃呈菌絲相生長(zhǎng)，37℃呈酵母相生長(zhǎng)，在溫度誘導(dǎo)下由菌絲相向酵母相進(jìn)行形態(tài)轉(zhuǎn)換的過程也被認(rèn)為是其毒力形成的過程。既往研究表明真菌毒力的強(qiáng)弱與基因組的多樣性有關(guān)，多數(shù)真菌是通過減數(shù)分裂實(shí)現(xiàn)基因組的多樣性變化，迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)孢子絲菌存在減數(shù)分裂，猜測(cè)孢子絲菌可能是通過改變核型來實(shí)現(xiàn)其基

2、因組多樣性的變化。沉默信息調(diào)控因子(Sir)參與對(duì)釀酒酵母與白念珠菌染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)控并進(jìn)一步誘導(dǎo)表型轉(zhuǎn)換。已證實(shí)Sir2同源蛋白在申克孢子絲菌酵母相特異性表達(dá)升高。
　　目的:(1)明確不同臨床類型孢子絲菌分離株以及不同時(shí)相（菌絲相、酵母相）的染色體核型是否存在差異。(2)克隆申克孢子絲菌Sir2基因全長(zhǎng)序列。(3)檢測(cè)申克孢子絲菌菌絲相與酵母相中Sir2基因的表達(dá)水平。
　　方法:(1)將兩株固定型孢子絲菌臨床分離株及兩株

3、皮膚淋巴管型孢子絲菌標(biāo)準(zhǔn)株于25℃SDA液基培養(yǎng)獲得菌絲相，于37℃BHI液基培養(yǎng)并傳代以保證向酵母相的轉(zhuǎn)化。以Schizosaccharomyces pombe strain972h-和Saccharomycescerevisiae strain YNN295為標(biāo)準(zhǔn)利用鉗位均勻電場(chǎng)(Controlled Homogenous ElectricField，CHEF)脈沖電泳的方法對(duì)不同時(shí)相的不同菌株進(jìn)行核型電泳分析。(2)提取標(biāo)準(zhǔn)株AT

4、CC10268總RNA后合成cDNA，然后依據(jù)不同真菌Sir2基因同源性對(duì)比設(shè)計(jì)引物，合成Sir2基因的保守區(qū)。再依據(jù)cDNA設(shè)計(jì)5種引物合成3'-RACE和5'-RACE。最后拼接成Sir2全長(zhǎng)序列。(3)用Realtime RT-PCR檢測(cè)菌絲相與酵母相中SsSir2基因表達(dá)水平的變化
　　結(jié)果:(1) CHEF結(jié)果顯示四株申克孢子絲菌有6-8條染色體，染色體大小610Kb-5700Kb，基因組大小23.6M-25.86M;四

5、株申克孢子絲菌間染色體數(shù)目、染色體大小、核型大小并不完全相同，但差異較小;相反，各菌株菌絲相與酵母相的核型基本相同。(2)提取酵母相孢子絲菌的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，克隆Sir同源基因，命名為SsSir2。SsSir2cDNA序列長(zhǎng)度為1753bp，開放閱讀框長(zhǎng)1329bp能編碼442個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)SsSir2分子量大小為48.1kDa，等電點(diǎn)為4.6。(3)應(yīng)用real-time RT-PCR檢測(cè)SsSir2在酵母相和菌絲相中表達(dá)