人工合成肺孢子菌p55蛋白串聯(lián)基因的克隆表達(dá)及產(chǎn)物分析.pdf

1、目的： 肺孢子菌肺炎(Pneumosystis pneumonia PCP)，是由肺孢子菌引起的一種機(jī)會(huì)感染性致命性肺炎。常見于AIDS、惡性腫瘤、器官移植及其他免疫功能不全的人群，隨著艾滋病在世界各地的蔓延流行，器官移植的開展，免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，肺孢子菌的機(jī)會(huì)性感染將成為一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。因此，國(guó)內(nèi)外有許多學(xué)者致力于PCP防治策略以及疫苗方面的研究，但是至今尚無理想的防治措施問世。肺孢子菌55 kDa蛋白(p55)是

2、肺孢子菌的主要抗原成分之一，能刺激宿主產(chǎn)生抗肺孢子菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)。但是肺孢子菌體外培養(yǎng)困難而致p55抗原來源受限，多個(gè)p55蛋白變異體的出現(xiàn)又使免疫效果受到影響，這些都對(duì)利用p55抗原進(jìn)行免疫防治研究十分不利。本實(shí)驗(yàn)是通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合生物軟件分析的方法，分析p55蛋白可能在肺孢子菌肺炎中起重要作用并具有較好抗原性參數(shù)的區(qū)域作為候選抗原表位，從5個(gè)p55蛋白變異體中共選取了十二個(gè)B細(xì)胞表位，將各表位進(jìn)行串聯(lián)后形成嵌合體，人工合成串聯(lián)

3、基因后進(jìn)行體外表達(dá)，為PCP疫苗的深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 一、抗原表位預(yù)測(cè) 運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)p55蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，親水性，穿膜螺旋，N-糖基化位點(diǎn)，氨基酸序列的親疏水性，表面可及性，分子柔韌性及抗原性參數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，設(shè)計(jì)抗原表位多肽。 二、基因合成和測(cè)序鑒定 設(shè)計(jì)多表位的串聯(lián)基因，命名為TAG，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公 司合成及測(cè)序驗(yàn)證。 三、TAG串聯(lián)基因原

4、核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 將該TAG基因克隆到GST融合蛋白表達(dá)載體pGEX-6p-1上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6p-1/TAG，受體菌為E. coli DH5 α菌株。將該含有該重組質(zhì)粒的菌株于37℃增菌，按照小量質(zhì)粒提取試劑盒方法將過夜培養(yǎng)菌液提取質(zhì)粒，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，行瓊脂糖凝膠電泳。 四、TAG串聯(lián)基因的擴(kuò)增及表達(dá) 將被證實(shí)的含有重組質(zhì)粒pGEX-6p-1/TAG的E.coliDH5α，在LB液體

5、培養(yǎng)基中37℃增菌，IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)，將菌體變性后進(jìn)行8％SDS-PAGE電泳。 五、Western Blotting分析 將表達(dá)目的蛋白和陽性對(duì)照GST蛋白的菌液離心后進(jìn)行超聲破菌，收集上清后100℃變性5min，8％SDS-PAGE電泳。45V，3h冰浴，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5％脫脂奶粉、0.1％BSA封閉2小時(shí)，以1:500稀釋濃度加入Anti-GST-Ab抗體，4℃過夜。PBST漂洗三次，加入HRP標(biāo)記羊抗兔I

6、gG，室溫孵育2h，用DAB顯色，30min內(nèi)觀察結(jié)果。 六、TAG表達(dá)蛋白的初步純化 提取包涵體，1、2、4、6M尿素充分振蕩、洗滌，將沉淀重懸含8M尿素的包涵體溶解緩沖液中于充分振蕩溶解包涵體后，4℃離心，收取上清，將沉淀用PBS重懸。將上清、沉淀作Western Blotting分析后，確定最好的洗滌濃度進(jìn)行大量純化，以為下一步實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備。 結(jié)果： 一、抗原表位設(shè)計(jì)及基因合成 選取目前報(bào)道

7、的肺孢子菌p55蛋白的5個(gè)變異體當(dāng)中有效抗原位點(diǎn)，共選取了十二個(gè)B細(xì)胞表位，將各表位進(jìn)行串聯(lián)，人工合成串聯(lián)基因，全長(zhǎng)1180bp，命名為TAG。 二、重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將串聯(lián)基因連接在原核表達(dá)載體pGEX-6p-1上，命名為pGEX-6p-1/TAG，該重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序證明堿基序列及讀碼框架完全正確。此外該重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamHI，NotI消化，經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)片段大小與預(yù)期吻合，質(zhì)粒構(gòu)建成功。

8、 三、TAG在原核細(xì)胞中表達(dá) 攜帶重組質(zhì)粒pGEX-6p-1/TAG的E. coli DH5α經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，8％SDS-PAGE電泳鑒定目的蛋白為分子量為69KD的GST融合蛋白，并出現(xiàn)于包涵體中。 四、Western Biotting印跡分析 分別攜帶質(zhì)粒pGEX-6p-1/TAG和pGEX-6p-1的E.coli DH5α表達(dá)出分子量約69KD的GST-TAG融合蛋白和約26KD的GST蛋白。We

9、stern Blotting結(jié)果表明這兩個(gè)蛋白能被Anti-GST-Ab識(shí)別，重組TAG蛋白被成功表達(dá)。 五、重組TAG蛋白的初步純化 尿素法純化重組TAG蛋白顯示其最佳洗滌濃度為4M尿素，用8M尿素進(jìn)行溶解可得較好效果。 結(jié)論： 本研究以生物信息學(xué)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了肺孢子菌p55蛋白抗原表位的串聯(lián)基因，成功地建立了表達(dá)多表位串聯(lián)基因的原核表達(dá)系統(tǒng)。為進(jìn)一步研制以該多表位串聯(lián)基因?yàn)榛A(chǔ)的疫苗研究奠定了良好的基礎(chǔ)