抗流感病毒B單抗雜交瘤細(xì)胞cDNA文庫的構(gòu)建及生物信息學(xué)分析.pdf

1、流行性感冒(influenza，簡稱流感)是由流行性感冒病毒引起的急性呼吸道傳染病，是人類面臨的主要公共健康問題之一。據(jù)統(tǒng)計，流感每年的發(fā)病率為10％～30％，其流行病學(xué)的特點是：突然暴發(fā)，迅速蔓延，播及面廣。流感流行具有一定的季節(jié)性。我國北方常發(fā)生于冬季，而南方多發(fā)生在冬夏兩季。流感發(fā)病率高，人群普遍易感。流感臨床癥狀較重，起病急驟，并發(fā)癥發(fā)生率高，特別是肺炎，可引起死亡，死者大多為年邁體弱和幼年多病或有慢性基礎(chǔ)病者。B型流感病毒近年

2、來常造成流感局部區(qū)域性暴發(fā)。 病毒的感染過程其實就是病毒與宿主或機體相互斗爭的過程。雜交瘤細(xì)胞是一種“1+1＞2”的特殊細(xì)胞，其分泌抗體的基因源于受到免疫原刺激的宿主免疫細(xì)胞--B細(xì)胞。她的基因組承載著病原體與宿主相互作用的信息，同時由于整合了腫瘤細(xì)胞的“長生基因”，使其成活時間明顯延長，而且極有可能產(chǎn)生一些基因的突變和重組，并由此產(chǎn)生一些抗體之外的新物質(zhì)。因此流感病毒B單抗雜交瘤細(xì)胞基因組的研究是一個值得探索的課題。如何迅速、

3、高效的從基因組中獲取生物學(xué)信息，是一個富有挑戰(zhàn)性的課題，EST技術(shù)就是基于這種認(rèn)識而發(fā)展起來的。 本試驗用純化的FluB抗原免疫小鼠，擬制備能穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，為研制一種方便、快捷、特異的金標(biāo)試紙快速診斷方法打下堅實的基礎(chǔ)，同時擬構(gòu)建分泌抗FluB抗體雜交瘤細(xì)胞cDNA文庫并測序，獲取EST片斷，再通過美國國家生物信息中心(NationalCenterBiotechnologyInformation，NCB

4、I)服務(wù)器的UniGene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST檢索，應(yīng)用sequencher軟件對EST序列進(jìn)行片斷重疊群分析，應(yīng)用生物信息學(xué)方法研究雜交瘤基因，為預(yù)測和進(jìn)一步開發(fā)雜交瘤細(xì)胞的功能提供理論基礎(chǔ)。 方法和結(jié)果： 1.應(yīng)用純化的B型流感病毒抗原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)過5次免疫、細(xì)胞融合、融合細(xì)胞的亞克隆，獲得了3株能穩(wěn)定分泌抗B型流感病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為：382，12G3，5A4。3株雜交瘤細(xì)胞株染色體計

5、數(shù)檢測顯示接近親本細(xì)胞染色體數(shù)目之和。3株單抗的重鏈均為IgG1型，輕鏈為κ鏈，單抗效價較高、與A型流感病毒和RSV均不發(fā)生交叉反應(yīng)。 2.應(yīng)用經(jīng)典cDNA文庫構(gòu)建方法，經(jīng)過細(xì)胞總RNA的提取、mRNA的分離，以帶有多聚腺苷酸的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，第二鏈，cDNA雙鏈和載體的連接，轉(zhuǎn)入受體菌，構(gòu)建成雜交瘤細(xì)胞的cDNA文庫。該文庫庫容為1.27×106。 3.原始文庫中挑選了400個克隆，測序共得到

6、384個序列，測序成功率為96％，將序列編輯后去除載體序列后得到長度在200bp～700bp的有效序列320條。經(jīng)過BLAST程序?qū)λ@得的EST片斷進(jìn)行基因，結(jié)果顯示有118條序列與數(shù)據(jù)庫中的已知基因有較好的相似性。經(jīng)過Sequencher4.8軟件將384條EST片斷的進(jìn)行片斷重疊群(contig)分析，結(jié)果共得到包括71條EST序列在內(nèi)的25組片斷重疊群，占全部EST序列的22.2％，其余249條都屬于單拷貝序列。 結(jié)論：