誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞中致瘤基因的生物信息學(xué)分析.pdf

1、眾所周知,表觀遺傳學(xué)、遺傳學(xué)的異常改變所引起的癌基因重激活和過表達(dá),會導(dǎo)致正常組織細(xì)胞向腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs;亦稱腫瘤起始細(xì)胞,tumor-initiating cells,TICs)的轉(zhuǎn)變,在獲得干性(stemness)和自我更新能力的同時(shí),亦擁有了很高的致瘤性。大量的研究表明,腫瘤干細(xì)胞在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥性中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。
　　2006年,Yamanaka等人在

2、干細(xì)胞研究領(lǐng)域開創(chuàng)了一個(gè)新的里程碑,他們用四種外源性因子(c-Myc、Nanog、Oct4和Klf4)轉(zhuǎn)染分化的成纖維細(xì)胞,成功地誘導(dǎo)產(chǎn)生了誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs),這種多能干細(xì)胞顯示出在臨床再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣闊應(yīng)用前景。然而,與CSCs類似的是,iPSCs也具有較高的致瘤性,這一點(diǎn)極大地阻礙了其在臨床干細(xì)胞治療方面的應(yīng)用。
　　CSCs、iPSCs和胚胎干細(xì)胞(e

3、mbryonic stem cells,ESCs)都具有干性和自我更新能力。在正常生理情況下,ESCs沒有致瘤性,而iPSCs卻能夠致瘤。除了上述四種Yamanaka因子外,iPSCs中是否還有其他致瘤基因被激活,是目前亟需解決的一個(gè)科學(xué)問題。此外,iPSCs誘導(dǎo)分化的細(xì)胞是否還存在過表達(dá)的致瘤基因和潛在的致瘤性,則是另一個(gè)需要解答的科學(xué)問題。
　　現(xiàn)代組學(xué)層次的高通量技術(shù)在iPSCs、CSCs和ESCs研究領(lǐng)域中的廣泛運(yùn)用,產(chǎn)生

4、了成千上萬的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)(gene expression profile data,GEPD),并存放于公開的數(shù)據(jù)庫中;其中絕大多數(shù)數(shù)據(jù)只是進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,其生物學(xué)意義尚未闡明。這些海量的數(shù)據(jù)為闡明iPSCs和CSCs中的致瘤基因及其作用機(jī)制,提供了一個(gè)很好的契機(jī)。
　　本研究旨在利用生物信息學(xué)分析,從浩瀚的iPSCs、CSCs和ESCs的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)中,揭示iPSCs及其誘導(dǎo)分化細(xì)胞中共表達(dá)的一致基因(consensus g

5、enes)及其潛在的致瘤性,并闡明iPSCs的致瘤機(jī)制,也為今后iPSCs及其誘導(dǎo)分化衍生物在臨床干細(xì)胞治療方面的安全使用的提供新的策略和警示。
　　首先,根據(jù)大家公認(rèn)的生物信息學(xué)工具和計(jì)算方法,建立了一個(gè)大規(guī)模基因表達(dá)譜的整合分析平臺,主要包括六個(gè)功能模塊:GEPD標(biāo)準(zhǔn)化、基因篩選和交集分析、基因富集分析、功能注釋、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,以及基因組織特異性表達(dá)數(shù)據(jù)庫和PubMed文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫的深度挖掘。利用該平臺,分別對CSCs

6、相關(guān)的14組基因表達(dá)譜(含100張芯片數(shù)據(jù))、ESCs相關(guān)的28組GEPD(含103張芯片數(shù)據(jù))、以及iPSCs相關(guān)的28組GEPD(含466張芯片數(shù)據(jù)),分別進(jìn)行整合與對比分析,揭示iPSC致瘤基因并闡明其生物學(xué)意義。
　　我們首先對CSCs和ESCs的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了整合與對比分析,分別揭示了2344個(gè)共同上調(diào)于CSCs的基因和4062個(gè)在ESCs中共同高表達(dá)的基因,這將用來與iPSCs進(jìn)行對比分析,以便區(qū)分正常干性相關(guān)基

7、因和致瘤相關(guān)基因。值得注意的是,2344個(gè)CSC一致基因中,含有14個(gè)癌基因,包括FOSB、FGR、RAB25、RAB33A、RAB38、RAB3A、RAP2A、RAP2B、KIT、SPI1、ERBB4、FOS、MAFF和BRAF。CSCs在激活正常干細(xì)胞信號通路(Wnt、Hedgehog、Notch)的同時(shí),也激活了腫瘤相關(guān)通路。有三個(gè)參與凋亡負(fù)調(diào)控的基因(ALB、INS、ANXA1)竟然是其相互作用網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)。這些發(fā)現(xiàn)有助于闡

8、明CSCs在腫瘤起始、發(fā)展和耐藥性中的作用機(jī)理。
　　另外,我們利用該平臺對更多的惡性腫瘤相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析,鑒別出4143個(gè)初步候選基因,通過功能注釋和文獻(xiàn)調(diào)研,候選基因被減少到314個(gè);進(jìn)一步使用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證,檢測這314個(gè)基因在62種不同的人類腫瘤細(xì)胞株和16種正常的人組織中的表達(dá);歷經(jīng)近兩年的努力,最終揭示出17個(gè)與CSCs和惡性腫瘤相關(guān)的新的腫瘤特異性基因。這17個(gè)基因不在正常人組織中

9、表達(dá)(睪丸除外),而在多種腫瘤細(xì)胞株中表達(dá),提示其腫瘤特異性。這些生物信息學(xué)分析和初步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果,為本研究室深入開展致瘤基因和惡性腫瘤發(fā)生的研究提供了有用的參考信息。
　　盡管iPSCs在干細(xì)胞治療方面展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景;然而,iPSCs的高致瘤性成為其在臨床再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用的最大障礙;迄今為止,除了上述四個(gè)Yamanaka因子之外,iPSCs中致瘤基因尚未見系統(tǒng)性的研究報(bào)道。為了探討iPSCs的致瘤性機(jī)制,我們利用上述整合

10、分析平臺,著重對源自11種不同分化細(xì)胞的iPSCs相關(guān)的28組基因表達(dá)譜數(shù)據(jù),進(jìn)行了整合分析,揭示了593個(gè)在iPSCs中高表達(dá)超過正常父本分化細(xì)胞10倍的iPSC一致基因,值得注意的是,其中有85個(gè)基因在iPSCs中的表達(dá)水平比正常父本分化細(xì)胞高100倍以上。令人驚訝的是,這593個(gè)iPSC一致基因中,有209個(gè)在多種人的腫瘤細(xì)胞株和惡性腫瘤組織中表達(dá);值得關(guān)注的是,其中有5個(gè)經(jīng)典的癌基因(RAC3、RAB25、PIM2、MYBL和T

11、ET1)在iPSCs中過表達(dá)。這些iPSCs一致基因的發(fā)現(xiàn),為揭示iPSCs的致瘤性提供了新的證據(jù)。此外,GO注釋深度分析表明,593個(gè)iPSC一致基因主要參與代謝過程、物質(zhì)運(yùn)輸、信號傳導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過程;細(xì)胞定位分析顯示,這些iPSC一致基因主要是膜相關(guān)蛋白,暗示iPSCs活躍的細(xì)胞內(nèi)外信號傳導(dǎo)。KEGG通路注釋揭示,干性相關(guān)的Wnt和Hedgehog信號通路中的9個(gè)基因被激活;其他被激活的信號通路包

12、括MAPK、Calcium和Chemokine等;這些被激活的信號通路相關(guān)基因中有9個(gè)是已知致瘤相關(guān)基因,暗示這些基因的激活與iPSCs的干性及其誘發(fā)的腫瘤發(fā)生有關(guān)。
　　目前,許多研究者將iPSCs作為干細(xì)胞的種子細(xì)胞,通過誘導(dǎo)分化形成功能性的分化細(xì)胞,應(yīng)用于干細(xì)胞治療,并期望iPSC誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞沒有致瘤性。然而,我們的生物信息學(xué)分析結(jié)果揭示,在iPSC誘導(dǎo)分化的肝細(xì)胞中仍然有27個(gè)iPSC一致基因異常高表達(dá),值得注意的是,

13、其中有一個(gè)癌基因RAB25,提示這些iPSC一致基因與腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和惡性腫瘤之間相互關(guān)聯(lián),以及iPSCs分化后仍然具有潛在的致瘤風(fēng)險(xiǎn)。
　　此外,許多研究者正試圖使用小分子化合物代替經(jīng)典的Yamanaka因子來制備可能更安全的iPSCs。我們的研究結(jié)果顯示,由小分子化合物誘導(dǎo)產(chǎn)生的iPSCs依然異常高表達(dá)153個(gè)iPSCs一致基因,其中包括兩個(gè)經(jīng)典的癌基因PIM2和RAC3,提示由小分子誘導(dǎo)產(chǎn)生的iPSCs的致瘤風(fēng)險(xiǎn)仍然無法消除。

14、
　　綜上所述,本研究揭示了iPSCs中異常高表達(dá)593個(gè)iPSC一致基因,其中209個(gè)基因與臨床研究腫瘤報(bào)道的腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。iPSCs誘導(dǎo)分化的細(xì)胞和小分子化合物誘導(dǎo)產(chǎn)生的iPSCs仍有致瘤基因高表達(dá),具有潛在的致瘤風(fēng)險(xiǎn)。這些研究成果為制定新的策略和方法,阻止iPSCs中致瘤基因的表達(dá),生產(chǎn)安全的iPSCs及其衍生物以用于臨床干細(xì)胞治療,提供了非常有用的參考信息;同時(shí),也為將來的iPSCs和CSCs中致瘤基因及其作用機(jī)制研究