中國大蒜遺傳多樣性評(píng)價(jià)及大蒜辣素含量與蒜氨酸酶基因的關(guān)聯(lián)分析.pdf

1、大蒜(Allium satiwum L.)為百合科(Liliaceae)蔥屬(Allium)重要的蔬菜兼藥用植物。中國是世界上最大的大蒜生產(chǎn)國和出口國。然而,我國大蒜研究基礎(chǔ)薄弱,對(duì)種質(zhì)資源遺傳背景和群體遺傳結(jié)構(gòu)尚不明確；無性繁殖大蒜不能人工雜交構(gòu)建常規(guī)作圖群體的難題也阻礙了大蒜辣素等重要性狀相關(guān)基因的挖掘。隨著國際市場(chǎng)對(duì)大蒜商品品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì),尤其對(duì)大蒜辣素含量要求的提高,迫切需要開展相關(guān)方面研究,以促進(jìn)我國大蒜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,保持

2、我國在大蒜國際貿(mào)易上的優(yōu)勢(shì)。
　　 本文通過對(duì)我國大蒜種質(zhì)資源表型性狀及AFLP、SSR和InDel三種分子標(biāo)記鑒定數(shù)據(jù)的分析,明確了我國大蒜資源遺傳背景和群體遺傳結(jié)構(gòu),為關(guān)聯(lián)作圖奠定了理論基礎(chǔ)；建立了大蒜辣素的超高效液相色譜(UPLC)檢測(cè)技術(shù)體系,對(duì)212份資源大蒜辣素含量進(jìn)行了檢測(cè)；通過TAIL,-PCR、RT-PCR技術(shù)獲得了大蒜辣素合成途徑中的關(guān)鍵基因.蒜氨酸酶基因的編碼區(qū),對(duì)其結(jié)構(gòu)和基因多樣性進(jìn)行了分析；根據(jù)蒜氨酸酶

3、基因內(nèi)含子2序列開發(fā)了一個(gè)InDel標(biāo)記,并對(duì)其與大蒜辣素含量的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了探討。主要結(jié)果如下:
　　 1.我國大蒜種質(zhì)資源的表型多樣性與分類。對(duì)資源圃保存的212份大蒜種質(zhì)資源的表型性狀進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定,統(tǒng)計(jì)分析表明我國大蒜種質(zhì)資源在表型變異很大,據(jù)此提出了21個(gè)數(shù)量性狀的5級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。為了避免質(zhì)量性狀在種質(zhì)評(píng)價(jià)中的主導(dǎo)作用,對(duì)與產(chǎn)量相關(guān)的鱗莖數(shù)量性狀進(jìn)行了重點(diǎn)分析,結(jié)果表明,構(gòu)成產(chǎn)量的數(shù)量性狀均表現(xiàn)較大變異。主成分分析顯示,前

4、三個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)74.83％,第一主成分中鱗莖重、鱗莖直徑和鱗芽數(shù)是影響產(chǎn)量的主要因子。鱗莖重和鱗莖直徑與產(chǎn)量相關(guān)性最大。通過主坐標(biāo)排序,將所有資源分為6類。通過綜合評(píng)價(jià),將大蒜鱗莖產(chǎn)量分為6個(gè)級(jí)別,篩選出單產(chǎn)大于15×103 kg ha-1的資源3份。
　　 2.基于AFLP、SSR和InDel標(biāo)記的大蒜種質(zhì)資源群體遺傳結(jié)構(gòu)和聚類分析。利用三種分子標(biāo)記技術(shù)在212份種質(zhì)中擴(kuò)增出502個(gè)位點(diǎn),多態(tài)性位點(diǎn)為492個(gè)。群體遺傳

5、結(jié)構(gòu)與聚類分析均將所有資源劃分為5個(gè)類群體。劃分的類別基本一致。然而,群體遺傳結(jié)構(gòu)分析劃分的5個(gè)群體,群體內(nèi)的遺傳信息多樣性指數(shù)較小。對(duì)212份種質(zhì)鱗莖大蒜辣素和21個(gè)數(shù)量性狀與群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行線型模型分析,結(jié)果表明包括大蒜辣素含量在內(nèi)的多個(gè)數(shù)量性狀受群體遺傳結(jié)構(gòu)的影響較小,說明我國資源圃中保存的大蒜種質(zhì)資源遺傳背景豐富,適合進(jìn)行相關(guān)分子標(biāo)記與表型性狀的關(guān)聯(lián)作圖分析。
　　 3.大蒜辣素超高效液相色譜(UPLC)檢測(cè)技術(shù)體系的建

6、立和應(yīng)用。通過對(duì)樣品處理、提取方法和檢測(cè)方法的研究,首次建立了完善的大蒜辣素超高效液相色譜(UPLC)檢測(cè)方法:使用UPLCBEHC18色譜柱,流動(dòng)相為甲醇:水=1:1,檢測(cè)波長為254nm,進(jìn)樣體積為1 uL,流速為0.3mL min-1。大蒜辣素在2.04～510mg L-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(R2=0.9991)。研究了大蒜辣素水提取液對(duì)酸堿溶液、溫度及光照的穩(wěn)定性,結(jié)果顯示大蒜辣素對(duì)溫度和強(qiáng)酸強(qiáng)堿敏感,對(duì)光照不敏感。在室溫下,

7、大蒜辣素在pH=6.0左右時(shí)較穩(wěn)定,5d內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯降解。但在pH低于1.5或高于11.0的強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件下,大蒜辣素降解迅速。當(dāng)溫度高于40℃時(shí),降解速度加快,高于70℃時(shí)降解明顯加速。提取液濃度較高,穩(wěn)定性便較強(qiáng)。利用建立的方法對(duì)212份大蒜鱗莖的大蒜辣素含量進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)資源圃中大蒜資源的大蒜辣素含量差異顯著,含量分布在0.82～3.01％之間,最高值與最低值相差近4倍。大蒜辣素含量與植株對(duì)蒜蛆抗性的關(guān)系分析表明,大蒜辣素含量越高

8、,大蒜對(duì)蒜蛆的抗性越強(qiáng),進(jìn)一步說明了大蒜辣素抗菌、殺蟲的生物活性。
　　 4.蒜氨酸酶基因編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)變異與品種演化分析。通過TAIL-PCR、RT-PCR技術(shù)獲得蒜氨酸酶基因編碼區(qū),從基因組水平及cDNA水平上研究了大蒜蒜氨酶基因編碼區(qū)的基因結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)蒜氨酸酶基因家族基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜,由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成。內(nèi)含子差異明顯,外顯子相對(duì)保守。4個(gè)內(nèi)含子長度和序列均有較大差異,存在很多InDel和重復(fù)序列。其中內(nèi)含子2多樣性最大

9、,而在外顯子1、3和5發(fā)現(xiàn)了InDel現(xiàn)象和單個(gè)堿基變異。通過對(duì)外顯子和內(nèi)含子分析,將蒜氨酸酶基因家族編碼區(qū)劃分為10個(gè)基因模式。其中內(nèi)含子2包括了所有基因模式。對(duì)來源不同的3份大蒜資源E1,GH1和CN313(E1來自烏孜別克的野生資源,GH1來自美國,CN313來自的中國)的蒜氨酸酶基因的基因組序列進(jìn)行聚類分析,在一定程度上證明了大蒜起源于中亞,而后逐漸向西方傳播,最后傳入東方的觀點(diǎn)。
　　 5.InDel標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用。

10、基于不同種質(zhì)蒜氨酸酶基因內(nèi)含子2序列,首次開發(fā)了InDel標(biāo)記,并對(duì)212份大蒜種質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè),在所有資源中共檢測(cè)到10個(gè)基因位點(diǎn),多態(tài)性為100％?；贗nDel標(biāo)記將212份大蒜劃分為5類,說明開發(fā)的蒜氨酸酶基因InDel標(biāo)記對(duì)資源遺傳多樣性及分類具有研究價(jià)值。
　　 6.大蒜辣素含量與蒜氨酸酶基因變異的關(guān)聯(lián)分析。首次對(duì)大蒜分子標(biāo)記(InDel標(biāo)記)和表現(xiàn)型(大蒜辣素含量)的相互關(guān)系進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,InDel基因型不同