大蒜蒜酶中試生產(chǎn)工藝、酶學(xué)性質(zhì)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究.pdf

1、大蒜(Allium sativum L.)為百合科蔥屬多年生草本植物，作為藥食兩用歷史悠久?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，大蒜主要具有抗感染、防治心腦血管疾病及抗腫瘤等三大功效。目前公認(rèn)大蒜的功效成分是蒜酶(Alliinase，EC 4.4.1.4)催化裂解蒜氨酸(Alliin)產(chǎn)生的大蒜辣素(Allicin)、阿霍烯(Ajoene)等系列含硫有機(jī)化合物。由于大蒜有效成分的分離、提取或人工合成十分困難，蒜氨酸及大蒜辣素等單體的價(jià)格十分昂貴，而且大蒜辣素

2、化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定，易分解，無法長期保存，目前的技術(shù)不可能直接制成藥物制劑應(yīng)用于臨床，因此，本項(xiàng)目組陳堅(jiān)教授在國內(nèi)率先提出：從鮮蒜中分別提取化學(xué)性質(zhì)相對穩(wěn)定的蒜氨酸及蒜酶，然后科學(xué)組方，制成蒜氨酸/蒜酶復(fù)合制劑，讓其在體內(nèi)釋放大蒜辣素、阿霍烯等有效成分，充分發(fā)揮療效。 本論文在前期研究工作的基礎(chǔ)上，利用新疆優(yōu)勢大蒜資源主要完成以下研究內(nèi)容： 第一大蒜蒜酶提取純化的實(shí)驗(yàn)室工藝研究。首先，建立了適用于提取中間體酶活力的測定方法

3、。即采用丙酮酸法測定酶活力，考馬斯亮蘭G-250法測定蛋白質(zhì)濃度，以此來計(jì)算比活力。然后，在大蒜蒜酶提取純化的實(shí)驗(yàn)室工藝研究中依次完成：①確定粗酶浸提液的最佳組成為Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液(pH6.5)中含10％(V/V)甘油、20μmol/L PLP、1mmol/L CaC12；②分別優(yōu)選35％飽和度硫酸銨、15％(m/v)PEG8000沉淀酶蛋白；③引進(jìn)超濾技術(shù)進(jìn)一步純化、濃縮酶蛋白；④確認(rèn)蒜酶最佳調(diào)節(jié)等電點(diǎn)為4.9。在

4、此基礎(chǔ)上，分別采用硫酸銨沉淀法和PEG8000沉淀法提取純化蒜酶各三批。利用實(shí)驗(yàn)室小試制得的蒜酶樣品建立了HPLC法測定終產(chǎn)物蒜酶活力；采用SDS-PAGE法測定蒜酶分子量為108.0kDa。通過對大蒜蒜酶提取純化的實(shí)驗(yàn)室工藝研究驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡恼_性、可行性，為大蒜蒜酶的中試生產(chǎn)研究積累數(shù)據(jù)、提供方法和經(jīng)驗(yàn)。 第二大蒜蒜酶中試生產(chǎn)工藝研究。利用中試生產(chǎn)設(shè)備和條件，進(jìn)行工藝放大研究：①確定蒜瓣浸提打漿以料液比分別為1:1和1:0

5、.5浸提兩次；②隨著浸提粗酶液濃度的改變，優(yōu)選硫酸銨沉淀酶蛋白的飽和度為45％；③選用Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液(pH6.5)作為蛋白沉淀的重溶液。通過對大蒜蒜酶中試生產(chǎn)工藝條件的進(jìn)一步優(yōu)化，以大蒜蒜酶提取純化的實(shí)驗(yàn)室工藝為基礎(chǔ)，制定蒜酶中試生產(chǎn)工藝流程和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，并采用硫酸銨沉淀法提取純化大蒜蒜酶三批次，跟蹤監(jiān)測中試生產(chǎn)全過程，最終蒜酶中試產(chǎn)品的活力和收率均達(dá)到并超過了設(shè)計(jì)要求。SDS-PAGE法測定結(jié)果顯示，蒜酶分子量

6、為107.8kDa，與實(shí)驗(yàn)室工藝研究結(jié)果極為接近，首次實(shí)現(xiàn)了大蒜蒜酶由實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模提取純化向機(jī)械化、自動(dòng)化程度較高的中試及大規(guī)模生產(chǎn)的過渡與轉(zhuǎn)化。此外，利用中試生產(chǎn)的車間、設(shè)備和條件，采用PEG8000沉淀法制備粗酶，為后續(xù)研制大蒜蒜酶對照品提供純度和活力均較高的蒜酶原料。 第三大蒜蒜酶的酶學(xué)性質(zhì)及其催化動(dòng)力學(xué)特性研究。利用中試產(chǎn)品，在對大蒜蒜酶的酶學(xué)性質(zhì)研究中，以天然蒜氨酸為底物，采用丙酮酸法測定蒜酶活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蒜酶具有熱

7、不穩(wěn)定性和pH不穩(wěn)定性；其酶解反應(yīng)選擇在35℃和pH7.00的緩沖體系中最佳；蒜酶溶解后，若放置較長時(shí)間，應(yīng)選擇在低溫(≤5℃)和pH6.5的緩沖體系中為宜。臨床常用溶劑中，含氯化鈉的注射液(不含葡萄糖)對蒜酶活力有顯著的激活作用，而含有葡萄糖的注射液則強(qiáng)烈抑制蒜酶活力。顯然，臨床應(yīng)用時(shí)，含有葡萄糖的注射液不宜作為蒜酶的配伍溶液。75％和95％乙醇作為消毒液使用時(shí)也應(yīng)避免其對蒜酶的殺傷作用。在對大蒜蒜酶/蒜氨酸催化動(dòng)力學(xué)研究中，采用丙酮