枯草芽孢桿菌生物膜在青枯病生防中的功能研究及CycliC-di-GMP信號(hào)通路初探.pdf

1、枯草芽孢桿菌與其他芽孢桿菌屬菌株是農(nóng)業(yè)上生防農(nóng)業(yè)病蟲害的重要生防菌之一，但其具體生防機(jī)理尚未清晰?？莶菅挎邨U菌生防植物病害的主效基因是什么？枯草芽孢桿菌生防菌施用后，以什么細(xì)胞形態(tài)存在于植物根圍區(qū)？枯草芽孢桿菌如何調(diào)控移動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)，游動(dòng)至植物根圍？枯草芽孢桿菌與寄主植物直接是否存在信號(hào)交流？如若存在信號(hào)交流，那么該途徑中的信號(hào)分子是什么？枯草芽孢桿菌如何接受來(lái)自寄主植物的信號(hào)分子并調(diào)控生防相關(guān)基因的表達(dá)？等等，這些關(guān)于枯草芽孢桿菌

2、生防機(jī)理深層次問(wèn)題的解決，將能更好更有效使用以枯草芽孢桿菌為主要成分的生物農(nóng)藥，推動(dòng)枯草芽孢桿菌的產(chǎn)業(yè)化。
　　本研究以生防枯草芽孢桿菌防治番茄青枯病為模型，系統(tǒng)研究了枯草芽孢桿菌生防番茄青枯病的機(jī)理，發(fā)現(xiàn)生物膜形成能力和其抗生物質(zhì)（主要為表面活性素）在生防青枯病中起主效作用。番茄根系分泌物通過(guò)激活枯草芽孢桿菌組氨酸激酶KinD，誘導(dǎo)生物膜的形成。研究還首次報(bào)道枯草芽孢桿菌C-di-GMP信號(hào)途徑調(diào)控細(xì)胞移動(dòng)性和生物膜形成，為研究

3、C-di-GMP途徑在枯草芽孢桿菌與寄主植物互作過(guò)程的信號(hào)交流奠定基礎(chǔ)。
　　1.生防枯草芽孢桿菌生物膜、拮抗能力與防治番茄青枯病相關(guān)性研究
　　本試驗(yàn)以生防枯草芽孢桿菌防治番茄青枯病為模型，系統(tǒng)研究了枯草芽孢桿菌生物膜形成能力和其抗生物質(zhì)（主要為表面活性素）在其生防青枯病中的作用。首先，從自然界根圍土中分離篩選得到60株芽孢桿菌菌株，通過(guò)16SrDNA測(cè)序鑒定其中20株為枯草芽孢桿菌。通過(guò)溫室防治青枯病試驗(yàn)選取其中防效高于

4、50％的6菌株進(jìn)行后續(xù)生防機(jī)理研究。野生型菌株都能形成生物膜，試驗(yàn)構(gòu)建了生物膜增強(qiáng)和減弱突變體并比較突變體溫室生防青枯病效果。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌生物膜能增加生防菌在根圍的定殖能力，其生物膜形成能力與生防活性呈正相關(guān)?？股镔|(zhì)也是生防枯草芽孢桿菌的生防機(jī)理之一。本研究構(gòu)建了不同抗生基因的突變體，通過(guò)乎板拮抗試驗(yàn)和溫室防病試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)表面活性劑在抑制青枯菌過(guò)程中起重要作用。本研究結(jié)果表明，生物膜形成能力和表面活性劑的產(chǎn)生能力是生防枯草芽孢桿

5、菌防治番茄青枯病的重要機(jī)理。研究中建立的番茄-枯草芽孢桿菌體系為研究生防菌-寄主植物互作提供基礎(chǔ)。
　　2.枯草芽孢桿菌組氨酸激酶KinD在寄主植物-枯草芽孢桿菌信號(hào)交流過(guò)程中功能研究
　　生防枯草芽孢桿菌能夠在植物根部及根圍形成生物膜并在防病促生過(guò)程中起著重要作用。但是，對(duì)于枯草芽孢桿菌與寄主植物這種友好的互作過(guò)程中的諸多細(xì)節(jié)報(bào)道較少。在互作過(guò)程中，枯草芽孢桿菌如何移動(dòng)至根表并定殖？寄主植物釋放的信號(hào)分子是什么？枯草芽孢桿

6、菌如何接受來(lái)自植物的信號(hào)分子并啟動(dòng)生物膜相關(guān)基因的表達(dá)繼而在根表形成生物膜保護(hù)寄主免受病原物的侵染？本研究通過(guò)建立一種基于無(wú)菌培養(yǎng)番茄植株與枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)的互作體系來(lái)研究?jī)烧咧g的互作過(guò)程，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌通過(guò)跨膜的紐氨酸激酶KinD接受植物釋放的信號(hào)分子，并通過(guò)構(gòu)建氨基酸點(diǎn)突變體，發(fā)現(xiàn)KinD蛋白結(jié)構(gòu)中CACHE功能域?yàn)樾盘?hào)分子的結(jié)合位點(diǎn)。番茄的根系分泌物能夠誘導(dǎo)Bacillussubtilis生物膜基因和KinD報(bào)道基因

7、sdp的表達(dá)。通過(guò)分離鑒定根系分泌物，并以KinD報(bào)道基因PsdpA-lux活性為篩選指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)根系分泌物中含有1種以上的活性物質(zhì)能夠增加PsdpA-lux活性，其中L-蘋果酸(L-MalicAcid)分子能夠通過(guò)增強(qiáng)KinD的活性，并增加生物膜的形成。
　　3.枯草芽孢桿菌C-di-GMP信號(hào)通路基因鑒定及其機(jī)制分析
　　C-di-GMP分子廣泛存在于細(xì)菌中，作為細(xì)菌的第二信使分子，其參與調(diào)節(jié)細(xì)菌游動(dòng)性、生物膜形成、寄主表

8、面定殖能力、致病性及細(xì)胞間信號(hào)交流等多種生理過(guò)程。已報(bào)道的關(guān)于C-di-GMP分子的信號(hào)通路研究主要集中于革蘭氏陰性細(xì)菌，而革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的報(bào)道甚少。本研究首次對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌模式菌枯草芽孢桿菌C-di-GMP信號(hào)通路的基因進(jìn)行分析，并初步探明C-di-GMP信號(hào)通路在枯草芽孢桿菌移動(dòng)性及生物膜形成過(guò)程中的作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，受SpoOA負(fù)調(diào)控的YuxH蛋白為磷酸二酯酶能夠降解細(xì)胞體內(nèi)的C-di-GMP分子。C-di-GMP分子受體蛋白

9、YpfA與C-di-GMP分子結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象變化并直接與細(xì)菌鞭毛動(dòng)力蛋白MotA互作來(lái)調(diào)控細(xì)胞的游動(dòng)性。C-di-GMP信號(hào)通路直接或間接地影響枯草芽孢桿菌生物膜的形成及降解過(guò)程。
　　4.總結(jié)
　　本研究的主要研究結(jié)果與創(chuàng)新點(diǎn)如下:1.從自然界中篩選得到的野生型枯草芽孢桿菌都能形成生物膜，且在各菌株中生物膜形成主要途徑是保守的;2.構(gòu)建了枯草芽孢桿菌-番茄的互作體系，通過(guò)比較野生型菌株及對(duì)應(yīng)生物膜突變體的生防青枯病效果，首