基于SAGE技術(shù)的家蠶雄性幼蟲高溫處理前后差異表達(dá)基因篩選及分析.pdf

1、家蠶是重要的絹絲經(jīng)濟(jì)昆蟲，具有重大的應(yīng)用和科研價(jià)值。研究家蠶幼蟲對(duì)高溫逆境環(huán)境的基因表達(dá)差異，對(duì)于闡明家蠶對(duì)高溫的反應(yīng)機(jī)制和培育抗高溫家蠶品種具有重要的理論意義。
　　本文以家蠶品種―7532‖雄性為試驗(yàn)材料，5齡期設(shè)置高溫組和常溫組，解剖家蠶5齡幼蟲餉食24h、72h和熟蠶的脂肪體、絲腺和中腸，提取各時(shí)期相關(guān)組織的總RNA，分別以雄性常溫和雄性高溫的各時(shí)期的混合組織為材料，運(yùn)用基因表達(dá)系列分析（SAGE）技術(shù)分別構(gòu)建家蠶5齡雄性

2、幼蟲高溫與常溫2個(gè)SAGE文庫(kù)，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶5齡雌性幼蟲高溫處理前后SAGE文庫(kù)，篩選出與性別無(wú)關(guān)的差異表達(dá)顯著的熱敏感標(biāo)簽和基因進(jìn)行了分析。獲得主要結(jié)果如下：
　　1. SAGE文庫(kù)的構(gòu)建與分析成功構(gòu)建了家蠶5齡雄性幼蟲高溫處理前后的2個(gè)SAGE文庫(kù)。對(duì)構(gòu)建的雄性常溫和高溫的2個(gè)SAGE文庫(kù)分析可得，雄性家蠶幼蟲常溫組和高溫組分別有355萬(wàn)和358萬(wàn)個(gè)原始標(biāo)簽（tags），通過(guò)兩個(gè)文庫(kù)的分析比較，獲得917個(gè)差異顯著的

3、基因，其中經(jīng)高溫處理后上調(diào)的基因有590個(gè)、下調(diào)的有327個(gè)。隨機(jī)選擇了3個(gè)基因用RT-PCR的方法驗(yàn)證SAGE標(biāo)簽出現(xiàn)的次數(shù)是否和對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)豐度相一致，結(jié)果表明文庫(kù)的數(shù)據(jù)是可靠的?；虮倔w論（GO）分析兩個(gè)文庫(kù)中的差異表達(dá)基因的歸類情況，發(fā)現(xiàn)它們分布相似的，說(shuō)明高溫前后這些基因都參與了類似的生理過(guò)程。通過(guò)對(duì)兩個(gè)家蠶 SAGE文庫(kù)中917個(gè)差異顯著基因的KEGG路徑分析，結(jié)果顯示有804個(gè)基因分布到142個(gè)KEGG路徑中，并且大部分

4、的路徑和代謝、生物合成和信號(hào)傳遞有關(guān)，這有助于鑒定家蠶抗高溫基因以及探究基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制。通過(guò)結(jié)合5齡雌性幼蟲高溫處理前后兩個(gè)SAGE文庫(kù)比較分析，篩選差異標(biāo)簽1876個(gè)，其中高溫后下降的標(biāo)簽955個(gè)，高溫后上升的標(biāo)簽921個(gè)，非性別因素高溫敏感性基因318個(gè)。其中高溫后上調(diào)基因124個(gè)，下調(diào)基因194個(gè)。通過(guò)對(duì)差異基因的GO分析可得在代謝、催化、綁定功能中富集較多。
　　2. GLGI擴(kuò)增無(wú)注釋信息的差異性tag標(biāo)簽 GLGI技

5、術(shù)是對(duì)SAGE文庫(kù)中未知基因挖掘的高效方法之一。通過(guò)GLGI技術(shù)擴(kuò)增，理論上可以得到較長(zhǎng)核苷酸序列片段在200 bp-1000 bp，實(shí)驗(yàn)中序列片段長(zhǎng)度相對(duì)短一些。本實(shí)驗(yàn)中選取了18個(gè)tag標(biāo)簽，最終得到13個(gè)標(biāo)簽的延伸序列，其中8個(gè)標(biāo)簽注釋到已知基因，有5個(gè)標(biāo)簽的延長(zhǎng)序列沒有匹配到任何基因，這些延伸序列有助于進(jìn)一步挖掘SAGE文庫(kù)中的未知基因。
　　3．2個(gè)差異基因的時(shí)空表達(dá)對(duì)分析篩選出的2個(gè)具有顯著性差異的基因分別是分別是熱激