雜色鮑變態(tài)差異表達(dá)基因篩選及TH信號通路作用分析.pdf

1、本論文以課題組測序獲得雜色鮑的核酸序列和GenBank數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，經(jīng)過生物信息學(xué)分析初步篩選，利用定量PCR獲得186個變態(tài)差異表達(dá)基因。根據(jù)差異表達(dá)基因在面盤幼蟲(VE)、匍匐幼蟲(CR)和變態(tài)后稚鮑(JU)的表達(dá)情況，利用Cytoscape構(gòu)建這些差異表達(dá)基因的作用網(wǎng)絡(luò)。發(fā)現(xiàn)TH信號通路在作用網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用。利用RNAi等初步分析了TH信號通路在變態(tài)過程中的作用。具體結(jié)果如下：
　　1)對篩選獲得的186個差異基因進(jìn)行G

2、O注釋和聚類分析。注釋結(jié)果顯示，這些差異基因編碼包括含鐵蛋白、核糖體蛋白、激素類蛋白、新陳代謝相關(guān)酶、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白、細(xì)胞周期蛋白以及一些轉(zhuǎn)錄因子等。其中與細(xì)胞、細(xì)胞器、大分子復(fù)合物等屬于細(xì)胞組分的序列最多。
　　2)采用Genorm、normFinder和RefFinder軟件分析EIF5A、OAZ1、YB1、RPL3、RPS9和ACT等6個候選內(nèi)參，在VE、CR和JU期三個時期以及RNAi條件下的VE期的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果表明

3、，在幼蟲的VE、CR和JU期，EIF5A為最合適的內(nèi)參基因；而在RNAi實驗中最佳內(nèi)參為RPS9。
　　3)方差分析186個差異表達(dá)基因的表達(dá)譜，表明有106個基因具有顯著性地表達(dá)差異。接著對這106個基因進(jìn)行功能分類，發(fā)現(xiàn)：參與免疫/應(yīng)激反應(yīng)的基因最多，有23個；參與蛋白質(zhì)翻譯過程和細(xì)胞代謝過程的基因也較多，都為13個；與細(xì)胞周期相關(guān)的基因有12個；另外膜蛋白有10個，轉(zhuǎn)錄因子有9個，與染色體組成相關(guān)的基因也有9個，與鈣離子結(jié)合

4、的有8個，與神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)的基因7個，未知基因2個。利用Cytoscape構(gòu)建了部分基因的作用網(wǎng)絡(luò)。以上結(jié)果表明，雜色鮑幼蟲的變態(tài)反應(yīng)是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，有眾多基因和信號通路參與，形成一個復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)。其中TH信號通路可能在網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用。
　　4)對TH信號通路相關(guān)基因在VE、CR和JU期的表達(dá)譜進(jìn)行整理分析TPO、TPO-1、IDIII、Intergrinαv和TRβ在變態(tài)過程中表達(dá)量具有顯著性差異(P<0.05)，發(fā)

5、現(xiàn)TPO基因在面盤幼蟲期表達(dá)量最高，隨后其表達(dá)量下降；TPO-1的表達(dá)量在面盤幼蟲期出現(xiàn)大幅度上升，隨后也下降；IDⅢ基因在變態(tài)后稚鮑表達(dá)量最高，且顯著高于另外兩個時期(P<0.05)；Integrinαv基因與IDⅢ的表達(dá)趨勢一樣，在變態(tài)后稚鮑表達(dá)量最高，且也顯著高于前兩個時期(P<0.05)；而TRβ在整個變態(tài)過程中的表達(dá)呈下降趨勢，且三個時期的表達(dá)量都呈現(xiàn)顯著性差(P<0.05)。
　　5)配置三個不同濃度的 T3溶液(分別

6、為10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L)，用于處理面盤幼蟲。結(jié)果表明，T3誘導(dǎo)能夠顯著影響幼蟲的變態(tài)率(P<0.05)，其中10-6mol/L的 T3顯著提高幼蟲的變態(tài)率(P<0.05)，而10-7mol/L、10-5mol/L濃度時效果則不顯著(P>0.05)。
　　6)運(yùn)用SMART-RACE技術(shù)克隆TRβ基因序列，其cDNA全長為1829bp，編碼399個氨基酸。其氨基酸序列中，具有兩個核受體家族的重要

7、功能域——DBD和 LBD。多重比對以及系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，其DBD和LBD功能域是高度保守的。
　　7)體外合成TRβ-dsRNA，RNAi面盤幼蟲。干擾6小時后發(fā)現(xiàn)，實驗組(TRβRNAi)幼蟲的變態(tài)率顯著降低，與陰性對照組(EGFP RNAi)和空白對照組(Non-treated)形成顯著差異(P<0.05)；實驗組幼蟲的死亡率則顯著提高，與兩對照組形成極顯著性差異(P<0.01)。這表明，TRβ基因沉默后對雜色鮑變態(tài)期幼蟲的

8、變態(tài)率和死亡率產(chǎn)生極大的影響。
　　8)利用qPCR檢測在TRβ基因沉默后TH信號通路相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，表達(dá)量顯著降低(P<0.05)的基因有TRβ、HIF-1α、STAT1和CCND1，其中TRβ、HIF-1α和 STAT1基因在 TRβ RNAi后表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；大多數(shù)基因如IntegrinαV、IDⅢ、β-catenin、PI3K、AKT、ERK、SrcK、GSK、TRAP、TPO