轉(zhuǎn)錄組分析雜色鮑在高溫和缺氧應(yīng)激下免疫相關(guān)基因及通路.pdf

1、雜色鮑（Haliotis diversicolor），隸屬軟體動物門(Mollusca)、腹足綱(Gastropoda)、前鰓亞綱(Prosobranchia)、原始腹足目(Archaeogastropoda)、鮑科(Haliotidae)、鮑屬（Halio tis）。雜色鮑自然分布于我國浙江以南沿海以及日本、越南等地，是我國南方沿海一種重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類。當(dāng)前隨著養(yǎng)殖業(yè)集約化的發(fā)展導(dǎo)致生產(chǎn)中面臨著應(yīng)激性疾病頻發(fā)的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，尤其在夏季水

2、體的高溫缺氧影響雜色鮑正常的生理狀態(tài)，降低其應(yīng)對外界病原侵染的能力，對鮑養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展產(chǎn)生較大的影響。
　　本研究通過二代高通量測序平臺Illumina HiseqTM2000對雜色鮑缺氧應(yīng)激下不同時(shí)相的血細(xì)胞進(jìn)行了大規(guī)模測序，比對了不同轉(zhuǎn)錄樣品之間的差異，篩選出差異表達(dá)和特異表達(dá)的unigenes。在轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的基礎(chǔ)上，篩選免疫相關(guān)的重要基因及免疫相關(guān)通路多個(gè)，重點(diǎn)研究了作為先天免疫調(diào)節(jié)過程中的重要信號通路PI3K-AKT

3、信號通路在雜色鮑應(yīng)對外界環(huán)境刺激的調(diào)節(jié)機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　1、對雜色鮑缺氧應(yīng)激下的14個(gè)血細(xì)胞RNA樣品進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序共獲得307395572reads，所有reads數(shù)經(jīng)拼接組裝后共產(chǎn)生99774條unigenes，其中有47154條unigenes獲得注釋，為后續(xù)挖掘與免疫調(diào)節(jié)機(jī)制相關(guān)的基因和通路提供了大量基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。對已拼接完成的unigene進(jìn)行篩選分析，共得到免疫通路相關(guān)基因242條。這些基因涉及PI3K-AK

4、T信號通路（PI3K-AKT signaling pathway）、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、P53信號通路(P53 signaling pathway)、NF-κB信號通路(NF-κB signaling pathway)、HIF信號通路(HIF-1 signaling pathway)等免疫、凋亡主要相關(guān)通路。對獲得的多個(gè)轉(zhuǎn)錄組的樣本進(jìn)行了生物信息學(xué)比較分析，得到多條差異表達(dá)unigenes，

5、其中缺氧應(yīng)激實(shí)驗(yàn)組0h樣本和對照組0h樣本之間具有最多的差異表達(dá)unigenes，共24189條，注釋率為59％;實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了41條篩選后的差異表達(dá)基因，其中27條的表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。
　　2、首次克隆獲得雜色鮑PI3K-AKT信號通路關(guān)鍵基因:磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶(protein-serine-threoni

6、nekinase，AKT)，并分別命名為HdAKT和HdPI3K。HdAKT cDNA總長2126bp，可編碼479個(gè)氨基酸，其中包含1440bp的開放閱讀框(ORF)，198bp的5'非翻譯區(qū)(UTR)和488bp的3'UTR。HdPI3K cDNA全長序列為6052 bp(GenBank登錄號:KX245017)，包括5'UTR496 bp，3'UTR2262 bp和3294 bp的ORF，可編碼1097個(gè)氨基酸。
　　3、選

7、擇了PI3K-AKT信號通路中的共14條相關(guān)基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。結(jié)果表明這14條基因在檢測的雜色鮑7個(gè)組織中均有廣泛表達(dá)，且HdAKT基因在血細(xì)胞中表達(dá)量最高(p＜0.05)，其次是肝胰腺(p＜0.05)，HdPI3K在血細(xì)胞的表達(dá)水平高于其他組織。在正常的溫度和溶氧條件下，副溶血弧菌感染后HdAKT，HdPI3K和其他PI3K-AKT信號通路成員基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，表明PI3K-AKT信號通路在雜色鮑先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮

8、重要的作用。但是當(dāng)處于環(huán)境應(yīng)激（高溫、缺氧和高溫＆缺氧聯(lián)合）條件下，再次受到弧菌感染時(shí)，這些基因的表達(dá)水平在鰓、血細(xì)胞和肝胰腺組織中被顯著抑制，表明PI3K-AKT信號通路可能參與雜色鮑在環(huán)境壓力下誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫抑制的過程，導(dǎo)致雜色鮑的免疫系統(tǒng)處于抑制狀態(tài)。
　　4、對雜色鮑血細(xì)胞中HdAKT基因進(jìn)行dsRNA干擾實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明:在dsRNA干擾血細(xì)胞后的各時(shí)相(4h、12h、24h)，HdAKT基因的表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著下調(diào)(P＜0

9、.05)。同時(shí)，PI3K-AKT信號通路相關(guān)基因的表達(dá)情況與綠色熒光蛋白組以及空白對照組相比也均有不同程度的顯著變化(P＜0.05)。同時(shí)利用Cytoscape構(gòu)建了HdAKTRNA干擾后PI3K-AKT信號通路相關(guān)基因各時(shí)相的相互作用網(wǎng)絡(luò)。隨著干擾時(shí)間的加長，HdAKT的干擾效果加深，PI3K-AKT信號通路相關(guān)基因也逐漸顯現(xiàn)出被抑制的趨勢，這一結(jié)果也說明了HdAKT在對上述基因的調(diào)控過程中起到了關(guān)鍵性的作用，并對PI3K-AKT信號