基于SAGE數(shù)據(jù)庫挖掘技術篩選分析前列腺癌相關新基因.pdf

1、隨著人類基因組計劃的初步完成，人們迎來了以轉錄組學和蛋白質組學為核心內容的后基因組(功能基因組)時代。研究人類基因功能最后注解基因以揭示生命活動機理是今后生物醫(yī)學研究至為重要而艱巨的任務。通過研究腫瘤差異表達基因的功能來闡明腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機理也是腫瘤研究的重要工作。前列腺癌為全世界特別是歐美國家男性常見的惡性腫瘤和主要死亡原因之一。我國隨著人口老齡化、生活習慣的改變及醫(yī)療檢測水平的提高，發(fā)病率逐年提高。篩選并研究前列腺癌與正常組織的

2、差異表達基因，不僅可幫助闡明前列腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機理，而且可為臨床提供有價值的診斷指標及治療的靶基因?；虮磉_高通量研究技術及生物信息學的發(fā)展，有力地推動了前列腺癌相關基因的研究。隨著美國癌癥基因組解剖計劃(CGAP)的實施，美國NCBI收錄了大量來自不同的正常及腫瘤組織的基因表達系列分析(SAGE)數(shù)據(jù)庫，分別通過CGAP提供的免費在線分析軟件就可以比較任意數(shù)據(jù)集組合之間的基因差異表達，進一步深入分析而得到相關腫瘤與正常組織的差異表

3、達基因。這種“硅片實驗”的分析結果都需要生物學實驗驗證，但它卻可以給研究者大量的實驗提示并減少實驗工作。因此，用公眾數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)新的前列腺癌相關基因，然后用生物醫(yī)學方法證實，最后針對興趣基因進行功能研究并解釋與前列腺癌發(fā)生發(fā)展的關系。不僅能為功能基因組學的注釋基因提供實驗依據(jù)，而且可為發(fā)現(xiàn)前列腺癌新的診斷方法及治療途徑奠定重要的理論及實驗基礎。 實驗方法： 通過選擇合理的數(shù)據(jù)庫及統(tǒng)計參數(shù)，利用NCBI提供SAGE數(shù)據(jù)庫

4、及分析軟件獲得在前列腺癌組織相對正常組織差異表達超過5倍SAGE標簽，然后進行標簽篩選、標簽對基因電子確認及GLGI確認，最后注釋差異表達基因的主要功能及與前列腺癌的關系并確定進一步研究的興趣基因。同樣方法得到在男性全身臟器組織中優(yōu)勢表達于前列腺組織的一系列基因，并確定進一步研究的興趣基因。針對在前列腺優(yōu)勢表達的新基因LOC389816，用RT-PCR在男性的主要臟器組織中驗證其表達情況，同時用生物信息學方法對新基因LOC389816進

5、行序列分析及功能預測。針對前列腺癌新的上調表達基因BRP44，NorthernBlot分析驗證在前列腺腺瘤及癌組織標本的差異表達，同時用生物信息學方法對基因BRP44進行序列分析及功能預測；構建BRP44與GFP融和表達真核載體，轉染高表達該基因的前列腺癌細胞株LNCaP，激光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白的亞細胞定位；體外轉錄法合成BRP44的siRNAs，轉染LNCaP細胞系降低BRP44的基因表達，觀察LNCaP細胞在BRP44表達降低

6、后細胞生長增殖曲線、細胞周期分布及分泌PSA的量的變化以初步了解BRP44在LNCaP細胞中可能的功能。 實驗結果： 1)得到代表前列腺癌差異表達基因的可靠SAGE標簽55條，分別代表著28條上調表達和27條下調表達基因，其中23條基因未見文獻報道與前列腺癌相關，可能為新的前列腺癌相關基因。確定功能完全未知的BRP44基因為進一步研究的興趣基因。得到代表前列腺優(yōu)勢表達基因的可靠標簽13條，其中9條已經(jīng)有文獻報道，另外4條

7、有希望成為前列腺新的優(yōu)勢表達基因。確定功能完全未知的LOC389816為進一步研究的興趣基因。用GLGI方法從30條不確定SAGE標簽中獲得2條cDNA片段，可能為在前列腺癌中上調表達的序列未知新基因或者某基因新的剪接體。 2)RT-PCR證實：在正常人的心、肝、結腸、肺、骨骼肌、睪丸、前列腺、皮膚、胃、腎臟、脾臟及胰腺共12種組織中，只在前列腺組織中檢測到了LOC389816基因的表達。生物信息學分析提示，LOC389816表

8、達的蛋白產(chǎn)物可能是一個具有信號傳導活性的膜受體蛋白。 3)NorthernBlot分析了10例前列腺癌組織，2個前列腺癌細胞系(PC-3及LNCaP)及8例前列腺腺瘤組織。結果證實BRP44在前列腺癌組織的表達豐度高于良性前列腺腺瘤組織，BRP44在LNCaP細胞中高表達而在PC-3中不表達。生物信息學方法初步推斷BRP44可能是一個在轉錄或者翻譯水平控制腫瘤細胞線粒體某些基因的表達的調節(jié)因子。GFP-BRP44融和蛋白在LNC

9、aP的細胞核及細胞漿均有表達，在胞漿的表達相比胞核更強。BRP44-siRNAs轉染LNCaP細胞24h后可以降解BRP44mRNA近60％，轉染48h后LNCaP細胞生長增殖加快，同時S期細胞顯著增加，而G0+G1、G2+M期細胞相應降低；但LNCaP細胞分泌PSA的量沒有變化。 結論： 1)利用公用生物信息學資源，基于SAGE數(shù)據(jù)庫挖掘技術篩選前列腺癌相關基因是一個相對簡單而可行的方法，可以為發(fā)現(xiàn)新的前列腺癌相關基因

10、提供線索。 2)基因LOC389816是一個在前列腺優(yōu)勢表達的新基因，其蛋白產(chǎn)物可能是一個具有信號傳導活性的膜受體蛋白，有希望成為前列腺癌診斷及治療的癌標。 3)BkP44是一個與前列腺癌相關的上調表達基因，其蛋白產(chǎn)物在LNCaP的細胞核及細胞漿均有表達，但在胞漿的表達相比胞核更強。BRP44可能是一個調控腫瘤細胞線粒體內某些基因表達的調節(jié)因子。BRP44對LNCaP細胞的生長增殖起著負向調節(jié)作用，在LNCaP細胞合成P