淇河鯽H2A與Ca-L-hipposin克隆和特征分析及其對(duì)細(xì)菌感染的表達(dá)響應(yīng).pdf

1、目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素的廣泛使用，導(dǎo)致病原微生物耐藥性的提高，抗生素富集與殘留，從而給水產(chǎn)品安全和人類健康帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。尋找高效、安全、廣譜新型抗菌制劑替代傳統(tǒng)抗生素迫在眉睫?？咕氖菨撛诘目股靥娲?，耐高溫，具有廣譜的抗菌活性，而且病原微生物不易產(chǎn)生耐藥性。目前抗菌肽已經(jīng)在醫(yī)學(xué)、畜牧養(yǎng)殖和食品保鮮等領(lǐng)域開(kāi)始使用。到目前為止，已經(jīng)報(bào)道的抗菌肽有1000余種，大多為兩親性陽(yáng)離子α-螺旋結(jié)構(gòu)抗菌肽，而魚(yú)類抗菌肽的研究相對(duì)較少。
　　本研

2、究基于GenBank中登錄的H2A保守區(qū)域，采用Primer5設(shè)計(jì)組蛋白H2A簡(jiǎn)并引物。以淇河鯽(CarassiusaurutusinQiheRiver)肌肉提取總RNA為模板、采用RT-PCR方法克隆H2A編碼區(qū)序列，通過(guò)膠回收和連接到載體，然后轉(zhuǎn)化到JM-109大腸桿菌中進(jìn)行克隆測(cè)序，最后成功獲得組蛋白H2A編碼區(qū)序列364bp。采用相同方法克隆青魚(yú)(Mylopharyngodonpiceus)、草魚(yú)（Ctenopharyngodo

3、nidellus）、鰱（Hypophthalmichthysmolitrix）和鳙(Aristichthysmobilis)組蛋白H2A基因序列。在線軟件分析發(fā)現(xiàn)均屬于不穩(wěn)定點(diǎn)蛋白質(zhì)，平均親水性范圍為-0.179～-0.264，PI值范圍為10.48～11.02。用DNAman分析淇河鯽、青魚(yú)、草魚(yú)、鰱和鳙組蛋白H2A編碼區(qū)基因同源性達(dá)到93％，氨基酸同源性達(dá)到99％。淇河鯽、青魚(yú)、草魚(yú)、鰱和鳙基因與狹孔金線鲃（Sinocycloche

4、ilusangustiporus）同源性達(dá)92％，同斑馬魚(yú)（Daniorerio）同源性為83％。相比較五種魚(yú)氨基酸與狹孔金線鲃同源性為98％，同斑馬魚(yú)同源性為91％，與其他物種的同源性偏低。
　　淇河鯽、青魚(yú)、草魚(yú)、鰱和鳙H2AN-端第2～52位（除去第1位甲硫氨酸）與庸鰈(Hippoglossushippoglossus)hipposin抗菌肽51個(gè)氨基酸相對(duì)應(yīng)，同源性極高。庸鰈hipposin抗菌肽不存在任何酸性氨基酸，為帶

5、15個(gè)正電荷的堿性抗菌肽，但是淇河鯽、青魚(yú)、草魚(yú)、鰱、鳙第1位的半胱氨酸被絲氨酸取代，第41位的組氨酸被谷氨酸取代，，顯示其電荷量為+14的陽(yáng)離子，空間結(jié)構(gòu)模型顯示為α螺旋結(jié)構(gòu)抗菌肽。用ExPaSy里的切割工具預(yù)測(cè)該淇河鯽組蛋白H2A可以被胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和嗜熱菌蛋白酶等52位水解成短肽，第1位的甲硫氨酸可以被胰凝乳蛋白酶水解和溴化氰試劑去掉。這51個(gè)氨基酸恰好對(duì)應(yīng)于庸鰈抗菌肽hipposin，經(jīng)過(guò)克隆驗(yàn)證將其命名為Ca

6、-L-hipposin抗菌肽。青魚(yú)、草魚(yú)、鰱、鳙在該位點(diǎn)也可被相應(yīng)的蛋白酶切割產(chǎn)生類hipposin抗菌肽。說(shuō)明淇河鯽、青魚(yú)、草魚(yú)、鰱和鳙組蛋白H2AN-端可衍生類hipposin抗菌肽。
　　克隆獲得淇河鯽組蛋白H2A開(kāi)放閱讀框ORF序列387bp，共編碼128個(gè)氨基酸，3'-UTR非編碼長(zhǎng)度為466bp，具有AATAAA的多聚腺苷酸終止信號(hào)位點(diǎn)，5'-UTR非編碼長(zhǎng)度為55bp，全長(zhǎng)共908bp。淇河鯽組蛋白H2A屬于陽(yáng)離子α

7、螺旋抗菌肽，其空間結(jié)構(gòu)同大西洋鮭（Salmosalar）、虹鱒魚(yú)（Oncorhynchusmykiss）、斑馬魚(yú)的組蛋白H2A空間結(jié)構(gòu)相似性達(dá)到96％。為組蛋白H2A基因及衍生類hipposin抗菌肽基因深入研究提供了分子基礎(chǔ)。
　　采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)淇河鯽在以下八個(gè)組織:肝臟、腎臟、腦、脾臟、鰓、心臟、肌肉、腸中mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示在淇河鯽8個(gè)組織當(dāng)中，組蛋白H2AmRNA表達(dá)在腎臟表達(dá)量最高，脾臟次之

8、，其次為鰓、腦、肝臟，其中表達(dá)量較少為腸道和心臟，肌肉中表達(dá)量最少。
　　采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)，采用2-ΔΔct方法分析淇河鯽腹腔注射嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)誘導(dǎo)表達(dá)組蛋白H2A和Ca-L-hipposin抗菌肽變化。嗜水氣單胞菌攻毒淇河鯽后，組蛋白H2A和抗菌肽Ca-L-hipposin在肝臟、脾臟和腎臟組織表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01**）。將兩者表達(dá)量做散點(diǎn)圖，通過(guò)擬合曲線分析，結(jié)果顯