鰻弧菌感染相關(guān)的牙鲆差異表達(dá)基因的克隆與分析.pdf

1、本研究以我國(guó)重要海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)牙鲆(Paralichthys olivaceus)為實(shí)驗(yàn)材料，利用mRNA差異顯示技術(shù)(mRNA(differential display，DD)研究了鰻弧菌感染前后差異基因的表達(dá)，通過(guò)RACE(Rapid amplification of cDNAends,RACE)技術(shù)克隆得到了兩個(gè)差異片段的全長(zhǎng)cDNA，利用生物軟件對(duì)基因的生物信息學(xué)進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，并借助于半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)基因的時(shí)空表達(dá)進(jìn)

2、行了較為詳細(xì)的研究，現(xiàn)將主要的研究結(jié)果分述如下： 1．DD-PCR分離鰻弧菌感染前后差異表達(dá)的牙鲆eDNA 采用DD-PCR．對(duì)鰻弧菌感染前后差異基因的表達(dá)進(jìn)行了研究，共得到20個(gè)感染前后在牙鲆肝臟、腎臟和脾臟中差異表達(dá)的cDNA片段。通過(guò)對(duì)差異片段的回收、再擴(kuò)增、克隆、測(cè)序、序列比對(duì)以及驗(yàn)證分析后，最終得到9個(gè)陽(yáng)性片段，其中兩個(gè)片段與已知基因高度同源：一個(gè)與牙鲆C3補(bǔ)體(Complement component3)同源

3、；另一個(gè)與牙鲆TEGT(testis—enhanced gene transcript)基因同源。其余7個(gè)為新的cDNA片段。 半定量RT-PCR結(jié)果表明，在檢測(cè)的7種組織中，C3補(bǔ)體只在對(duì)照組的肝臟中微量表達(dá)，注射鰻弧菌6h后在小腸中開(kāi)始了表達(dá)，而且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在肝臟和小腸中的表達(dá)量呈逐漸增加的趨勢(shì)，推測(cè)C3補(bǔ)體在牙鲆鰻弧菌中起著重要的免疫調(diào)節(jié)作用。 組織表達(dá)分析表明，TEGT基因在所檢測(cè)的對(duì)照組7個(gè)組織中均為組成

4、型表達(dá)，鰻弧菌感染后的6h，在各個(gè)組織中的表達(dá)量均增加，其中脾臟增加的最明顯，是對(duì)照組的2倍，此后TEGT基因在脾臟中的表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)而呈下降的趨勢(shì)；注射后的24h時(shí)，TEGT基因在肝臟和腎臟中的表達(dá)量達(dá)到最大，此后也隨時(shí)間延長(zhǎng)而呈下降的趨勢(shì)。這說(shuō)明TEGT基因存在組成型和誘導(dǎo)型兩種表達(dá)機(jī)制，在防御病原菌的侵染過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的作用。 2.牙鲆IL-1RII基因全長(zhǎng)cDNA的克隆及分析 通過(guò)DD-PCR和RACE技術(shù)

5、克隆得到了牙鲆白介素1受體類(lèi)型Ⅱ(IL-1RII)基因的全長(zhǎng)cDNA。序列全長(zhǎng)1793bp，包括一個(gè)100bp的5'末端非翻譯區(qū)(Untranslated region，UTR)、430bp的3'UTR和長(zhǎng)度為1263bp的開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)。其中在3'UTR區(qū)還發(fā)現(xiàn)了3個(gè)重復(fù)的AU(ATTTA)序列。其ORF編碼的蛋白含有420個(gè)氨基酸，其中含有一個(gè)16個(gè)氨基組成的信號(hào)肽，該蛋白預(yù)測(cè)的分子量為4

6、6.65KD，等電點(diǎn)為7.19。生物軟件分析表明，該蛋白具有IL-R.家族的典型結(jié)構(gòu)特征：含有兩個(gè)Ig樣的結(jié)構(gòu)和一個(gè)跨膜區(qū)；二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明它屬于混合型蛋白，空間結(jié)構(gòu)和人IL-1RI晶體結(jié)構(gòu)模型非常相似。通過(guò)和真鯛等魚(yú)類(lèi)以及鼠、人等哺乳動(dòng)物IL-1RII基因的序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)脯氨酸殘基的保守位點(diǎn)(第155、263、268位)；同源性分析表明該序列和真鯛、虹鱒的相似性比較高，分別為60.0％和47.4％，在構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中首先聚在了

7、一起，然后再和小鼠、猴、人等哺乳動(dòng)物聚集在一起。半定量RT-PCR檢測(cè)表明，IL-1RII在正常牙鲆的大多數(shù)組織中均表達(dá)，注射鰻弧菌6小時(shí)后在腎臟和脾臟的表達(dá)量顯著增加，分別是對(duì)照組的1.9倍和2.0倍。初步分析表明它具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，在防御細(xì)菌侵染的過(guò)程中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。 3.牙鲆TM4SF4基因全長(zhǎng)cNA的克隆及分析 借助于DD-PCR和RACE克隆得到了牙鲆四跨膜超家族成員4(TM4SF4)基因的全長(zhǎng)cDN

8、A。該cDNA全長(zhǎng)1257bp，其中5'UTR為174bp，3'UTR為489bp，ORF為594bp，可編碼197個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)的分子量約為20.58KD，等電點(diǎn)為4.48。它具有四個(gè)疏水性跨膜區(qū)和三個(gè)保守的CCG(Cys-Cys-Gly)骨架等TM4家族的典型特征結(jié)構(gòu)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)一段27個(gè)氨基酸組成的序列(<'53>GSGvLMIFPALVFL GLKNNDCCGCCGN<'79>)在所比較的9個(gè)物種中高度保守。同源性分析表明

9、該基因的蛋白序列與魚(yú)類(lèi)以及哺乳動(dòng)物類(lèi)具有高度的相似性，與河豚的同源性最高為80.2％，與斑馬魚(yú)、爪蟾、鼠、猴、人、狗、牛的同源性分別為：68.5％、64.5％、68.0％、65.5％，66.5％、66.5％、66.5％。 組織表達(dá)分析表明，牙鲆TMM4SF4基因在對(duì)照組的脾臟和腎臟中都只有極其微弱的表達(dá)，但鰻弧菌感染以后的6h在脾臟中的表達(dá)量急劇增加，達(dá)到對(duì)照組的5.2倍，注射后的24h在腎臟中的表達(dá)量也急劇增加，是對(duì)照組的4.