滸苔DMSP裂解酶L(dddL)基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、二甲基硫（DMS）是海洋中主要的揮發(fā)性硫化物，對(duì)全球氣候變化及硫循環(huán)有重要影響。二甲基巰基丙酸（DMSP）是 DMS的重要前體，在 DMSP裂解酶的作用下分解為 DMS和丙烯酸。DMSP是海洋植物產(chǎn)生的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，大量存在于海藻和鹽生高等植物體內(nèi)。含有DMSP的生物體死亡之后，DMSP被海洋細(xì)菌的二甲硫醚生成酶降解，生成二甲硫醚(DMS)和丙烯酸。DMS從海洋水面逸出，進(jìn)入大氣形成酸雨；由于 DMS能形成云，所以有降低溫室效應(yīng)的作用。

2、DMSP本身則對(duì)哺乳動(dòng)物、禽類及水產(chǎn)動(dòng)物(魚和蝦)的營(yíng)養(yǎng)代謝有促進(jìn)作用。酶學(xué)研究表明，動(dòng)物肝臟中的兩種硫甲基轉(zhuǎn)移酶能把 DMSP分子中硫原子上的甲基轉(zhuǎn)移出來(lái)，提供給機(jī)體代謝所需。作為海洋植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的主要成分，DMSP來(lái)源于植物體內(nèi)的蛋氨酸。DMSP裂解酶存在于不同的細(xì)菌中，也存在于一些藻類體內(nèi)。
　　克隆分離了滸苔的 DMSP裂解酶 dddL基因。首先應(yīng)用 PCR技術(shù)方法擴(kuò)增dddL的部分 DNA序列。結(jié)果表明，獲得的部分

3、DNA序列和 NCBI登錄海洋細(xì)菌的 dddL的序列相似度非常高，可以初步確定為該酶在滸苔中 DNA序列。其次應(yīng)用染色體步移的方法分別對(duì) dddL部分基因序列的5′上游序列和3′下游序列進(jìn)行擴(kuò)增。最后利用5′RACE技術(shù)，獲得一個(gè)克隆序列。在此基礎(chǔ)上對(duì)這3個(gè)片段序列進(jìn)行拼接，獲得滸苔 dddL基因的全長(zhǎng)序列與5′端啟動(dòng)子序列。閱讀框編碼223個(gè)氨基酸殘基。推導(dǎo)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為24.74 kDa，等電點(diǎn)為8.45。dddL氨基酸序列的

4、同源性分析顯示，細(xì)菌和滸苔的dddL氨基酸序列都具有較高的同源性。跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，dddL編碼的蛋白含有一段跨膜區(qū)。這些結(jié)果對(duì)進(jìn)一步研究 dddL基因的結(jié)構(gòu)與功能以及從基因調(diào)控角度探索 DMSP的裂解過(guò)程有重要意義。
　　DMSP具有多重作用，除了作為藻類中的滲透調(diào)節(jié)劑、抗凍劑、抗氧化劑等，還可以用來(lái)作為誘食劑，不僅能促進(jìn)海水和淡水魚蝦的生長(zhǎng)還能提高它們的應(yīng)激能力以及改善肉質(zhì)等。綠藻中的 DMSP含量很高，因而可用作 DMS

5、P生產(chǎn)的原料。滸苔是一種常見的大型綠藻，利用熒光定量 RT-PCR技術(shù)對(duì)不同脅迫條件處理的滸苔 dddLmRNA的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。不同鹽度（10‰-60‰）處理組中，10‰鹽度處理組的滸苔 dddL mRNA表達(dá)量最高。30‰、40‰、50‰和60‰鹽度處理組之間 dddL mRNA表達(dá)量較低且無(wú)顯著差異。
　　為進(jìn)一步研究滸苔 dddL的生物學(xué)功能，將滸苔 dddL基因的開放閱讀框區(qū)域克隆到表達(dá)載體 pEASY-E2中，并