雞腸道Cajal間質細胞與腸神經(jīng)系統(tǒng)的特性研究.pdf

1、新近的觀點認為正常的腸道蠕動依賴于腸壁中腸神經(jīng)系統(tǒng)(Enteric NervousSystem，ENS)、Caja1間質細胞(interstitial cells of Caja1，ICC)和平滑肌細胞之間的相互作用。ICC是位于自主神經(jīng)末梢和消化道平滑肌細胞之間的一類特殊的間質細胞，它在三個方面起作用:胃腸道平滑肌活動的起搏，推進電活動的傳播和調節(jié)神經(jīng)遞質。以往關于ENS和ICC的研究主要集中在哺乳動物胃腸道。鳥類與哺乳動物的胃腸道在

2、結構上存在一定差異性，同時，鳥類的腸神經(jīng)系統(tǒng)不僅包括腸壁內(nèi)的神經(jīng)叢，還包括位于腸管外腸系膜緣的腸神經(jīng)(又稱Remak's nerve)。這種差異是否導致ENS和ICC結構及其作用機制的不同？
　　 本研究以雞作為試驗動物，詳細研究了雞腸道內(nèi)ICC的鑒定、分布以及與神經(jīng)、平滑肌之間的聯(lián)系，并對雞NES中與ICC關系最為密切的NOS和AChE陽性神經(jīng)元進行了胚后發(fā)育和分布比較研究。研究結果將從細胞和分子水平闡明雞ENS和ICC的結構

3、組成和相互聯(lián)系，對揭示鳥類胃腸道功能有著重要意義，為鳥類胃腸動力學疾病治療提供科學依據(jù)。
　　 試驗Ⅰ雞腸道Caja1間質細胞的超微結構研究本試驗應用透射電鏡系統(tǒng)觀察了雞腸道Caja1間質細胞(interstitial cells of Caja1，ICC)的超微結構特點，結果顯示在雞腸道的不同部位均有ICC的存在，分布密度不等。根據(jù)分布位置的不同可將ICC分為肌間ICC、肌內(nèi)ICC、粘膜下層ICC、深肌層ICC和固有層ICC。

4、電鏡下，這些ICC具有共同的超微特征:存在大量的線粒體、豐富的中間絲;細胞核呈梭形或橢圓形，內(nèi)含大量異染色質。ICC胞體呈梭形或星形，有數(shù)量不等的胞質突起，這些突起與周圍平滑肌細胞和腸道神經(jīng)形成密切聯(lián)系。部分ICC也顯示了平滑肌細胞的一些結構特點，如不連續(xù)的基底膜、胞膜小凹和致密體。ICC之間，以及ICC與鄰近的平滑肌細胞之間存在著明顯的縫隙連接樣結構。與哺乳動物不同，雞回腸固有層也分布有ICC。在雞腸道組織中，成纖維細胞的分布也較為豐

5、富，它們與ICC的主要區(qū)別在于其具有發(fā)達的分泌性細胞器，包括囊泡和不連續(xù)的基底膜，但缺乏中間絲和胞膜小凹。雞腸道ICC的分布、超微結構特點及其與其它細胞的聯(lián)系表明，ICC在雞消化道動力學機制中發(fā)揮著重要的調控作用。ICC在粘膜固有層的分布，提示雞腸道ICC可能比哺乳類具有更多的亞型。
　　 試驗Ⅱ雞腸道的C-kit陽性細胞表達與分布由于缺乏合適的標記物，Caja1間質細胞(interstitial cells of Caja1，

6、ICC)在禽類腸道的分布未見資料報道，本試驗在第三章對雞腸道ICC超微結構鑒定的基礎上，應用合成的三相探針通過原位雜交方法，檢測ICC的標記物c-kit mRNA在雞腸道不同區(qū)域的分布規(guī)律;同時，應用實時熒光定量PCR(RT-PCR)分別對不同腸段粘膜組織和去粘膜腸壁組織的c-kit mRNA表達進行測定。原位雜交結果顯示出兩種類型的c-kit mRNA陽性細胞。第一種為紡錘形或星極細胞組成，主要位于內(nèi)環(huán)形肌和外縱形肌之間的肌間層，粘膜

7、下層、環(huán)形肌和縱形肌內(nèi)也有發(fā)現(xiàn)。這種類型的細胞被界定為ICC。進一步根據(jù)此類細胞分布位置不同可分為肌間ICC、肌內(nèi)ICC和粘膜下ICC三種，而且不同腸段內(nèi)陽性細胞數(shù)目也不相同。第二種為圓形或顆粒型細胞組成，主要位于粘膜固有層內(nèi)，粘膜下層也有少量發(fā)現(xiàn)，這類細胞被界定為肥大細胞，主要分布于回腸和空腸。RT-PCR結果顯示在不同腸段均有c-kit mRNA的表達:在去粘膜腸壁組織中，回腸和結腸表達最高，空腸和十二指腸次之，盲腸最低;而在粘膜組

8、織中，空腸表達最高，十二指腸和回腸其次，結腸和盲腸最低。實驗結果揭示了雞腸道ICC的分布模式，顯示了雞腸道不同部位中c-kitmRNA表達差異，這種差異可能與不同腸段的功能及其調節(jié)方式有關。
　　 試驗Ⅲ不同日齡雞腸道c-kit與其配體SCF mRNA的表達研究本試驗以β-actin為內(nèi)參，采用SYBR染料法的實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術。選取第1、10、20和40日齡三黃雞去除粘膜后的十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結腸

9、腸壁中c-kit及其配體SCF mRNA的表達進行相對定量，初步闡明正常雞腸道中c-kit及其配體SCF的mRNA表達量隨著日齡變化的規(guī)律。結果顯示所有腸段中c-kit mRNA的表達量從1日齡至40日齡逐漸降低，至20日齡時c-kit mRNA表達極顯著低于1日齡。SCFmRNA的表達量從1日齡至10日齡逐漸升高，10日齡時mRNA表達最高，之后慢慢下降，至20日齡時的SCF mRNA表達顯著低于10日齡。各腸段在不同日齡的c-kit

10、和SCF mRNA表達量的變化表現(xiàn)如下:1日齡時，結腸中c-kit mRNA表達量最高，回腸最低;十二指腸中SCF mRNA表達量最高，盲腸最低。10日齡時，結腸中c-kitmRNA表達量最高，空腸最低;結腸中SCF mRNA表達量最高，盲腸最低。20至40日齡時，變化趨于穩(wěn)定，都是回腸中c-kit和SCF mRNA表達量最高，盲腸最低。結果表明雞腸道的胚后發(fā)育和功能形成是一個逐漸成熟的過程，而且c-kit及其配體SCF之間存在著密切的

11、聯(lián)系。
　　 試驗Ⅳ雞腸道Vimentin與NSE免疫熒光雙標研究本試驗采用ICC的標記物之一波形蛋白(vimentin)和神經(jīng)元的特異標記物神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron-specific Enolase，NSE)，對腸道切片進行免疫細胞化學雙標，觀察雞不同腸段內(nèi)vimentin、NSE陽性細胞的分布特征，探究ICC與神經(jīng)之間的聯(lián)系。結果發(fā)現(xiàn):vimentin陽性細胞及其突起主要分布在肌層、粘膜下層和固有膜內(nèi)，特別是在內(nèi)環(huán)

12、形肌和外縱形肌之間的肌間層大量出現(xiàn)。陽性細胞在大腸與小腸的肌內(nèi)分布稍有區(qū)別，前者主要見于肌間隔內(nèi)，而后者主要見于肌束內(nèi)。大部分NSE陽性細胞分布于肌間層和粘膜下層，肌層內(nèi)有零散分布;固有膜NSE陽性細胞量較少，但小腸固有膜vimentin陽性細胞明顯多于大腸。粘膜上皮附近也能觀察到。通過雙標觀察，腸道肌間和粘膜下層vimentin陽性細胞緊密圍繞在NSE陽性細胞周圍。固有膜內(nèi)vimentin陽性細胞也多位于NSE陽性細胞周圍。表明雞vi

13、mentin細胞與NSE陽性細胞在腸道各段呈交錯分布，兩者關系緊密，提示它們在腸道活動中存在一定調節(jié)關系。
　　 試驗Ⅴ雞腸道肌間層NOS陽性神經(jīng)元胚后發(fā)育的結構研究腸神經(jīng)系統(tǒng)(Enteric Nervous System，ENS)的正常發(fā)育對了解腸道功能是非常重要的。雞胚是研究肌間神經(jīng)叢發(fā)育和ENS功能的理想模型，但關于雞胚后肌間神經(jīng)叢的發(fā)育未見報道。本研究的目的是定性和定量分析胚后發(fā)育期間雞肌間神經(jīng)叢NOS陽性神經(jīng)元（即氮能

14、神經(jīng)元）的形態(tài)和分布。分別對7日齡、15日齡和成年雞不同腸段（十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結腸）進行肌間鋪片制作，還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黃遞酶(NADPH-d)組織化學反應后，利用IPP6.0軟件對陽性神經(jīng)元和神經(jīng)節(jié)進行定量分析。結果顯示NOS陽性神經(jīng)元和神經(jīng)纖維形成典型的三級網(wǎng)狀結構，NOS陽性神經(jīng)元形態(tài)各異，聚集在一起構成大小不等的神經(jīng)節(jié)。NOS陽性神經(jīng)元反應強度存在一定差異，數(shù)個陽性神經(jīng)元經(jīng)?？尚纬纱樾魏蚒形結構。NOS陽

15、性神經(jīng)元和神經(jīng)節(jié)的密度隨著年齡的增長而降低，但神經(jīng)節(jié)中的陽性神經(jīng)元的數(shù)量卻有所增加。在所有年齡組中，NOS陽性神經(jīng)元數(shù)量在結腸最高，隨后是回腸，空腸，十二指腸和盲腸。結果表明，雞腸道肌間神經(jīng)叢存在胚后發(fā)育現(xiàn)象，提示雞ENS功能形成是一個逐漸成熟和完善的過程;另外在每個腸段之間的發(fā)育并無明顯差異，提示不同腸段的功能執(zhí)行在出生后就已確定。
　　 試驗Ⅵ雞回腸粘膜下層膽堿能神經(jīng)元的胚后發(fā)育研究乙酰膽堿能神經(jīng)元釋放的乙酰膽堿(ACh)是

16、胃腸道最主要的興奮性神經(jīng)遞質，能刺激平滑肌收縮，增強胃腸道分泌，促進腸道激素的釋放。本研究分別制作0、5、10、20、40日齡三黃雞回腸粘膜下層鋪片樣品，通過乙酰膽堿酯酶(AChE)組織化學反應，探究0日齡到40日齡雞腸道粘膜下神經(jīng)叢膽堿能神經(jīng)元的構筑及其變化。結果顯示AChE陽性神經(jīng)元和神經(jīng)纖維形成立體的三級網(wǎng)狀結構，AChE陽性神經(jīng)元形態(tài)各異，聚集在一起構成大小不等的神經(jīng)節(jié)。隨著年齡的增長神經(jīng)節(jié)密度明顯降低，直到40日齡組。相反，神

17、經(jīng)節(jié)中神經(jīng)元大小逐漸增加，40日齡組中幾乎是0日齡組的3倍。在胚后發(fā)育初期，每個神經(jīng)節(jié)中的神經(jīng)元數(shù)量從10日齡起，基本呈現(xiàn)穩(wěn)定上升的趨勢。雞回腸粘膜下神經(jīng)叢胚后發(fā)育變化的研究結果，將為雞的腸神經(jīng)系統(tǒng)失調引起的胃腸道疾病診斷提供重要的病理組織學參考。
　　 試驗Ⅶ雞回腸段膽堿能和氮能神經(jīng)元的組織化學定位分別制作雞回腸冰凍切片、肌間和粘膜下層鋪片，應用乙酰膽堿酯酶(AChE)和還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黃遞酶(NADPH-d)組織

18、化學反應，分別對膽堿能和氮能神經(jīng)元進行定位分析。冰凍切片結果顯示AChE和NADPH-d陽性反應廣泛分布于神經(jīng)元胞體和神經(jīng)纖維中。陽性神經(jīng)元呈不規(guī)則或多邊形，主要在肌間和粘膜下層零星或成簇出現(xiàn)，肌內(nèi)也有一定的分布。肌間陽性神經(jīng)纖維可明顯插入環(huán)形肌內(nèi)，陽性神經(jīng)纖維經(jīng)常圍繞在血管周圍，也有一些陽性神經(jīng)纖維從肌層發(fā)出，穿過粘膜下層進入粘膜固有層，并且滲透到腸絨毛上皮下;肌內(nèi)和粘膜中的AChE神經(jīng)纖維的數(shù)量遠超過NADPH-d陽性神經(jīng)元和神經(jīng)纖