誘導(dǎo)型Ds轉(zhuǎn)座載體的構(gòu)建及其在擬南芥和玉米中的應(yīng)用.pdf

1、變異材料的篩選和鑒定是開(kāi)展分子遺傳學(xué)研究的先決條件之一，而目前轉(zhuǎn)座子法篩選變異材料和克隆功能基因是主流方法之一。轉(zhuǎn)座子法中，Ac/Ds(Activator/Dissociation)標(biāo)簽系統(tǒng)是構(gòu)建插入突變體庫(kù)較為理想的方法。Ac-Ds系統(tǒng)是玉米hAT家族中的成員，包括自主轉(zhuǎn)座元件Ac和非自主轉(zhuǎn)座元件Ds，AcTPase能在自身轉(zhuǎn)座酶的作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)座，Ac不斷自主轉(zhuǎn)座，使轉(zhuǎn)座植株難以穩(wěn)定，不利于研究。因此，本論文將具有自主轉(zhuǎn)座能力的AcT

2、Pase加以改造使其能夠合成轉(zhuǎn)座酶，但是缺失轉(zhuǎn)座序列，喪失轉(zhuǎn)座能力。Ds元件不具有編碼轉(zhuǎn)座酶的功能，只有在A(yíng)c轉(zhuǎn)座酶存在的情況下才能轉(zhuǎn)座。誘導(dǎo)型表達(dá)轉(zhuǎn)座酶基因，可以使轉(zhuǎn)座過(guò)程變得可控，既能顯著提高轉(zhuǎn)座頻率，又能快速穩(wěn)定插入事件。
　　 我們知道擬南芥屬還有30％的基因功能是未知的，運(yùn)用我們提供的這一方法，通過(guò)Ds的切離和再插入實(shí)驗(yàn)可以很好地展開(kāi)轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法克隆功能基因的目的，為更好地研究擬南芥以及其他物種中的功能基因提供了一個(gè)可

3、行方便的方法。特別是對(duì)玉米等糧食作物來(lái)說(shuō)，將會(huì)有很深遠(yuǎn)的意義。本實(shí)驗(yàn)首先在擬南芥上測(cè)試兩個(gè)系統(tǒng)的可行性，然后進(jìn)一步應(yīng)用于玉米。這將有助于人們對(duì)整個(gè)植物界的認(rèn)識(shí)，改善農(nóng)作物的品質(zhì)，提高農(nóng)作物的抗逆性以及降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對(duì)環(huán)境的影響。
　　 本實(shí)驗(yàn)中，主要研究結(jié)果：
　　 1)驗(yàn)證兩載體的誘導(dǎo)功能。將pHL1轉(zhuǎn)化擬南芥，得到單拷貝純合體株系后，通過(guò)熒光定量PCR方法分析其誘導(dǎo)情況，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后，AcTPase表達(dá)量有十幾倍的

4、增加。將pHL2載體轉(zhuǎn)化擬南芥，得到單拷貝純合體株系后，通過(guò)GUS染色，有GUS藍(lán)斑出現(xiàn)，證明誘導(dǎo)作用有效。
　　 2)驗(yàn)證兩載體的轉(zhuǎn)座功能。將pHL1轉(zhuǎn)化擬南芥，得到單拷貝純合體株系后，對(duì)植株進(jìn)行誘導(dǎo)，通過(guò)GUS染色，巢式PCR分析Ds空供體位點(diǎn)等方法分析Ds-GFP元件轉(zhuǎn)座情況，結(jié)果顯示，有Ds-GFP轉(zhuǎn)座事件的發(fā)生。將pHL2載體轉(zhuǎn)化擬南芥，得到單拷貝純合體株系后，誘導(dǎo)后，通過(guò)GUS染色，結(jié)果顯示有Ds-GFP轉(zhuǎn)座事件的發(fā)