豬圓環(huán)病毒診斷及含CpG基序核酸疫苗對小鼠的免疫作用研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）屬于圓環(huán)病毒科，是一種小的、無囊膜的單鏈負股環(huán)狀DNA病毒。圓環(huán)病毒共有2個基因型，分別為無致病性的PCV1和有致病性的PCV2。PCV2病毒粒子侵入機體后可引起B(yǎng)淋巴細胞凋亡，導(dǎo)致機體免疫力下降，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的威脅。針對PCV2的鑒定和檢測已有許多方法，如ELISA、IFA、PCR等，但是這些方法過程繁瑣、耗時較長或者人為操作誤差較大。而熒光定量PCR技術(shù)具有快速、靈

2、敏、高特異性等特點，因此被越來越多的應(yīng)用于各種病毒的檢測。
　　 本研究利用普通PCR技術(shù)擴增出PCV2的ORF2基因702bp片段，并克隆到pVAX1載體，以純化的質(zhì)粒作為PCR檢測的標準模板，以10倍梯度稀釋質(zhì)粒為陽性標準品，摸索熒光定量PCR試驗，并繪制標準曲線，以此建立一種熒光定量PCR特異性檢測豬圓環(huán)病毒的方法。結(jié)果表明，該方法對PCV2有很好的特異性，其敏感性比常規(guī)PCR高100倍，批間與批內(nèi)重復(fù)試驗變異系數(shù)均小于2

3、.5％。經(jīng)臨床應(yīng)用表明熒光定量PCR方法的建立實現(xiàn)了對PCV2特異性的快速診斷和定量檢測。
　　 在利用豬腎臟細胞(PK-15)培養(yǎng)PCV2病毒中很容易污染無致病性的PCV1，給PCV2的純化與培養(yǎng)帶來困難。本研究還建立了一種多重?zé)晒舛縋CR檢測技術(shù)以快速區(qū)分PCV1和PCV2。本研究設(shè)計了3條引物，其中D1是PCV1和PCV2共享引物。結(jié)果表明，PCV1和PCV2擴增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm)分別為84.5±0.20℃和86.6

4、±0.03℃，可以根據(jù)熔解峰的不同來區(qū)分。反應(yīng)的靈敏度分別可達到1×101拷貝/uL和1×102拷貝/uL，且與PRV、PRRSV和PPV無交叉反應(yīng)。此方法為監(jiān)控細胞毒的純化培養(yǎng)提供了簡便快捷的方法。
　　 為了研究含CpG基序的核酸疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫作用，將40只6周齡Balb/c小鼠隨機分為四組，其中:A組是PBS對照組，B組是pVAX1空載體組，C組是pVAX1-ORF2疫苗組，D組是18CpG-pVAX1-ORF2-疫

5、苗組。各組均采用肌肉注射，每次200μL，疫苗有效成分含量100μg，2周后按相同途徑和劑量進行第二次免疫，二免后4周用0.2mL的PCV2SD株細胞培養(yǎng)物(106.0TCID50/ml)接種小鼠，檢測抗體變化情況并進行病理組織學(xué)觀察。試驗結(jié)果表明，注射疫苗后各組小鼠沒有明顯癥狀，攻毒后A、B組小鼠呈現(xiàn)微觀剖檢病變，疫苗組無病變。核酸疫苗pVAX1-ORF2和18CpG-pVAX1-ORF2均有一定的免疫刺激作用，但18CpG-pVAX