靶向DEC-205的豬圓環(huán)病毒Capsid疫苗的設(shè)計(jì)及其免疫應(yīng)答研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)是一種導(dǎo)致豬群免疫力下降的病毒,并與豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合癥(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS)、豬皮炎及腎病綜合癥(Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome,PDNS)等多種疾病有著聯(lián)系。疫苗是預(yù)防和控制豬群PCV感染的有效方式,目前已研發(fā)出病毒滅活苗、亞單位疫苗等多種

2、 PCV疫苗,但存在疫苗制備工藝復(fù)雜,減毒疫苗的低安全性、亞單位疫苗低免疫原性免疫保護(hù)效力局限等一些問題。豬圓環(huán)病毒主要由衣殼蛋白Cap蛋白和基因組構(gòu)成,其中Cap蛋白是公認(rèn)的主要免疫保護(hù)性抗原,將是PCV疫苗研制的有效候選抗原。
  DEC-205是一種表達(dá)于大多數(shù)APCs表面的受體,屬于甘露糖受體家族,在抗原內(nèi)化、處理及提呈的過程中扮演重要角色,尤其在對外源性抗原交叉提呈的過程中受到廣大研究者的關(guān)注。目前國內(nèi)外許多研究表明:將

3、病毒的主要保護(hù)性抗原,如gag(Human Immunodeficiency Virus,HIV),EDⅢ(Dengue Virus,DENV),通過化學(xué)或者基因工程技術(shù)將抗原與抗DEC-205單抗偶聯(lián),利用抗DEC-205抗體特異性靶向DEC-205特性,從而使抗原更加精確的靶向抗原提呈細(xì)胞,進(jìn)而介導(dǎo)抗原提呈細(xì)胞對抗原高效的內(nèi)化、處理以及提呈,最終誘導(dǎo)強(qiáng)勁的特異性免疫應(yīng)答。
  本文選取了2型豬圓環(huán)病毒(Porcine circ

4、ovirus,PCV2)主要結(jié)構(gòu)蛋白(Capsid protein, Cap)作為研究對象,將抗DEC-205單鏈抗體(single chain antibody fragment against DEC-205, scFvDEC205)與Cap蛋白融合表達(dá),制備出靶向DEC-205的豬圓環(huán)病毒疫苗scFvDEC205-Cap。通過動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn),分析和評(píng)價(jià)其細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答水平以及抗體中和作用,同時(shí),對豬圓環(huán)病毒疫苗 scFvDE

5、C205-Cap靶向樹突狀細(xì)胞增強(qiáng)抗原遞呈的作用和機(jī)制進(jìn)行了初步研究,將為研制安全高效的豬圓環(huán)病毒疫苗奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
  主要工作內(nèi)容和結(jié)果有如下幾點(diǎn):
  ①豬圓環(huán)病毒疫苗scFvDEC205-Cap的構(gòu)建、重組表達(dá)與純化
  通過分子克隆技術(shù),構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET22b-scFvDEC205,并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)超聲裂解,包涵體變性,親和層析純化、蛋白質(zhì)復(fù)性,最終純化出重組scFvDEC205-Cap蛋白。目

6、的蛋白經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定分析。
  ②豬圓環(huán)病毒疫苗scFvDEC205-Cap的免疫應(yīng)答分析
  體液免疫結(jié)果顯示:免疫scFvDEC205、GFP兩種蛋白的小鼠一免及二免后血清中抗Cap蛋白特異性抗體效價(jià)為陰性,免疫Cap蛋白誘發(fā)的小鼠血清抗Cap蛋白一免二免特異性抗體效價(jià)分別為1:200和1:1600;然而免疫融合蛋白scFvDEC205-Cap的小鼠血清抗Cap蛋白特異性效價(jià)明顯高于單純

7、的免疫注射Cap蛋白(P<0.05),一免二免效價(jià)值達(dá)到1:800和1:6400。免疫融合蛋白scFvDEC205-Cap抗體效價(jià)略低于PCV2滅活苗(1:1600和1:12800),但差異性并不顯著(P>0.05);誘發(fā)中和抗體是疫苗的另一重要特征,本研究將二免28天分離的血清稀釋后與PCV2孵育,然后將抗體病毒混合液感染PK-15細(xì)胞,最后通過抗 Cap單克隆抗體檢測 PK15細(xì)胞內(nèi)病毒載量。與 ELISA結(jié)果一致,scFvDEC-

8、205和GFP蛋白組中和抗體效價(jià)顯示為陰性,Cap組的中和抗體效價(jià)為1:12,而重組scFvDEC205-Cap蛋白激發(fā)的小鼠中和抗體效價(jià)達(dá)到1:16,明顯高于Cap組(p<0.05);PCV2滅活苗組的抗體效價(jià)要遠(yuǎn)高于其他四組,其數(shù)值達(dá)到1:20。細(xì)胞免疫結(jié)果是利用scFvDEC205-Cap刺激體外分離培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞,通過ELISPOT進(jìn)行檢測分析。結(jié)果顯示:陰性組(scFvDEC205和GFP蛋白)表達(dá)IL-4和IFN-γ細(xì)胞數(shù)

9、量均值分別為:185/182和190/193;scFvDEC205-Cap表達(dá)IL-4和IFN-γ細(xì)胞數(shù)量均值分別為:680/700高于Cap組395/410;略低于PCV2組710/720。
  ③豬圓環(huán)病毒疫苗 scFvDEC205-Cap靶向增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞抗原遞呈功能的作用機(jī)制初探。
  流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示,scFvDEC205-Cap能夠在體外條件下刺激骨髓樹突狀細(xì)胞(bone marrow-derived cel

10、ls,BMDCs)成熟,且與Cap蛋白相比大腸桿菌表達(dá)的scFvDEC205-Cap與BMDCs結(jié)合效率更高(P<0.05),這說明scFvDEC-205能夠誘導(dǎo)BMDCs成熟且能夠特異性地與BMDCs表面甘露糖受體DEC-205結(jié)合。ELISA和ELISPOT結(jié)果顯示:負(fù)載scFvDEC205-Cap的BMDCs可刺激脾淋巴細(xì)胞分泌表達(dá)IL-17、IFN-γ和IL-4,同時(shí),T細(xì)胞分泌表達(dá)IFN-γ的能力要強(qiáng)于IL-4。此外,抗原提呈

11、阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:添加抑制劑后淋巴細(xì)胞在與負(fù)載scFvDEC205-Cap蛋白的DCs培養(yǎng)之后,表達(dá)IFN-γ的能力明顯低于未添加任何抑制劑的空白對照組(p<0.05),此結(jié)果說明DEC-205介導(dǎo)Cap蛋白的抗原提呈過程中可能涉及到交叉提呈途徑。
  以上研究結(jié)果顯示:與傳統(tǒng)的亞單位疫苗Cap相比,scFvDEC205-Cap可通過scFvDEC205的靶向作用,增強(qiáng)APCs的抗原加工處理與遞呈作用,有效激發(fā)小鼠產(chǎn)生更強(qiáng)的體液免

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