雙抗體夾心ELISA與免疫組化法在兔產(chǎn)氣莢膜梭菌病診斷中的應(yīng)用研究.pdf

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）能夠引發(fā)畜禽各種產(chǎn)氣莢膜梭菌病，并且易引起人類食物中毒，氣性壞疽，嚴(yán)重影響人類健康，因此對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌病的診斷尤為重要。各型產(chǎn)氣莢膜梭菌均能產(chǎn)生α毒素，因此α毒素的檢測(cè)能夠?yàn)樵\斷產(chǎn)氣莢膜梭菌病提供強(qiáng)有力的證據(jù)。
　　本研究對(duì)2015年10月到2016年12月期間采集的山東省3個(gè)規(guī)?；脠?chǎng)30只疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌病兔進(jìn)行診斷。利用臨床癥狀、剖檢結(jié)果、組織病理學(xué)檢查對(duì)疑似產(chǎn)氣

2、莢膜梭菌病兔進(jìn)行初步診斷；運(yùn)用細(xì)菌分離鑒定、DAS-ELISA法和免疫組化法作為主要方法，對(duì)疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌病兔進(jìn)行診斷。
　　臨床癥狀觀察和剖檢結(jié)果顯示，疑似自然感染產(chǎn)氣莢膜梭菌病兔的臨床特征和各個(gè)器官的病變與產(chǎn)氣莢膜梭菌病變特征相符；組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，肝細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性、空泡變性，小腸、盲腸黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落，黏膜下層充血。通過(guò)細(xì)菌分離，分離到疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株共計(jì)25株，分離率為83.3％，經(jīng)多重PCR

3、鑒定均為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。
　　以抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素單克隆抗體（monoclonal antibody，MAb）為捕獲抗體建立DAS-ELISA方法，優(yōu)化反應(yīng)條件，以α毒素稀釋濃度（用小鼠LD50的倍數(shù)表示）的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，OD450nm為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線用于定量檢測(cè)，對(duì)建立的DAS-ELISA方法進(jìn)行性能評(píng)價(jià)并應(yīng)用于臨床檢測(cè)。優(yōu)化后的DAS-ELISA方法批內(nèi)檢測(cè)變異系數(shù)均低于10%，批間檢測(cè)變異系數(shù)均低于12%，結(jié)果

4、表明該方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。運(yùn)用該方法測(cè)定產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素含量的最低檢測(cè)限為0.353倍的小鼠LD50，可有效檢測(cè)范圍為0.353-90.368倍小鼠LD50；以健康兔作為陰性對(duì)照，患產(chǎn)氣莢膜梭菌病的兔群腸內(nèi)容物中α毒素水平顯著高于健康兔群（P＜0.05）；當(dāng)疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌病兔腸內(nèi)容物OD450nm值大于0.3578時(shí)判斷為陽(yáng)性，檢測(cè)為陽(yáng)性的病兔有26例，陽(yáng)性檢出率為86.7%。同時(shí)采取疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌病兔的回腸、胃、腎臟、

5、肝臟做免疫組化，驗(yàn)證DAS-ELISA法結(jié)果，以至少有一個(gè)器官檢測(cè)到α毒素作為陽(yáng)性判定依據(jù)，檢測(cè)為陽(yáng)性的病兔有27例，陽(yáng)性檢出率為90%。
　　以抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素單克隆抗體為基礎(chǔ)，利用免疫組化對(duì)30只病兔的16種器官中α毒素的分布進(jìn)行了檢測(cè)，在自然感染產(chǎn)氣莢膜梭菌病兔的心臟、脾臟、肺臟、盲腸、結(jié)腸、膀胱、蚓突、延腦等器官中檢測(cè)到了α毒素的分布，其中，胃、肝臟、腎臟等組織中α毒素信號(hào)較強(qiáng)。綜合上述幾種方法的檢測(cè)結(jié)果表明：2015