大菱鲆紅體病的病原檢測研究.pdf

1、大菱鲆是我國一種重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類，但是近年來大菱鲆紅體病的頻繁暴發(fā)，已嚴重影響了大菱鲆的健康養(yǎng)殖。大菱鲆紅體病通常表現(xiàn)為鰭基部和腹面脊椎骨沿線充血發(fā)紅。但是，人們隨后發(fā)現(xiàn)大菱鲆紅體病的病原是多樣性的，既有病毒性的，也有細菌性的，甚至某些寄生蟲的感染也使大菱鲆呈現(xiàn)相似的紅體癥狀，因而給大菱鲆紅體病的及時診治帶來極大的困難。因此，運用可靠有效的大菱鲆病原檢測技術(shù)和方法，及時診斷大菱鲆紅體病病原，以對癥下藥，對于保證大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)

2、展具有一定的意義。
　　本文于2011年3月、9月、10月和12月以及2012年1月，分別從山東半島沿海的4個大菱鲆養(yǎng)殖場先后收集了5個批次的疑似紅體病的患病大菱鲆，對其分別進行了病理癥狀觀察和病原檢測，共發(fā)現(xiàn)了3種病例，即細菌性紅體病、病毒性紅體病以及弧菌與病毒混合感染紅體病。
　　病理癥狀觀察的結(jié)果表明，2012年1月所收集病魚的癥狀不屬于紅體癥狀，其他4個批次患病大菱鲆均呈現(xiàn)明顯的紅體癥狀，其無眼側(cè)皮膚均可見到不同程度

3、的皮下組織出血發(fā)紅，但不同病原所引發(fā)的紅體病癥狀存在一定的差異：由致病性弧菌感染致病的紅體大菱鲆，其鰓絲為鮮紅色，而感染病毒的紅體大菱鲆，鰓絲通常為暗紅色，或是呈貧血灰暗?？梢?，鰓絲顏色是否灰暗貧血是病毒性紅體病區(qū)別于細菌性紅體病較明顯的病理特征。另外，當病情嚴重時，皮膚潰爛流血是細菌性紅體病的最有力的病理特征。
　　水浸片光鏡檢測寄生蟲的結(jié)果顯示，所有批次的病魚中均未檢測到寄生蟲，因此，可以確定的是，所檢各批次大菱鲆紅體病都不是

4、由寄生蟲感染所引起的。弧菌選擇性培養(yǎng)基檢測致病性弧菌的結(jié)果表明，2011年9月、10月和12月所收集的3個批次的紅體大菱鲆均感染了弧菌，選擇性培養(yǎng)基TCBS培養(yǎng)基上均長出黃色的弧菌菌落。電鏡負染檢測和組織超薄切片電鏡檢測的結(jié)果顯示，2011年3月和12月收集到的紅體大菱鲆均檢測到了病毒粒子。因此，病原檢測的診斷結(jié)果為，9月和10月收集的大菱鲆紅體病為細菌性紅體?。?月份收集的紅體大菱鲆為病毒性紅體??；而12月份收集的紅體大菱鲆既感染了弧

5、菌，又檢測到了病毒，因此該批次大菱鲆為弧菌和病毒混合感染紅體病。
　　在大菱鲆病毒性紅體病和混合感染紅體病中，所觀察到的病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)均一致。病灶組織所制備的病毒粗提液經(jīng)負染，在電鏡下觀察到球形的病毒顆粒，直徑為120~130nm，有的具囊膜，有的無囊膜。在病魚皮膚病灶組織的電鏡切片中也觀察到病毒粒子，位于感染細胞的細胞質(zhì)中，病毒顆粒為球形，直徑約130nm，與負染結(jié)果一致，同時還觀察到感染細胞內(nèi)的線粒體腫脹，嵴崩解。

6、　　采用細胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）檢測方法驗證了分離出的病毒粒子能夠使牙鲆鰓細胞（FG）出現(xiàn)CPE效應(yīng)。本文用病毒粗提液去感染FG單層培養(yǎng)細胞，3天后細胞出現(xiàn)明顯的細胞病變效應(yīng)：細胞變圓、脫落；9天后，大量細胞變圓、脫落和聚縮成團，細胞病變效應(yīng)加劇；11天后，大部分細胞崩解死亡。可見CPE現(xiàn)象隨著時間的推移而逐漸加劇，最終導致細胞系統(tǒng)崩解。同時采用電鏡觀察了病變FG細胞的病理變化，雖然在感染病毒的FG細胞

7、中未觀察到典型的病毒粒子，但發(fā)現(xiàn)細胞中溶酶體和次級溶酶體增多增大，細胞質(zhì)勻質(zhì)化并形成大量空泡，并有疑似病毒包涵體的結(jié)構(gòu)，而且病變細胞的體積比對照細胞肥大。本文用病變細胞上清培養(yǎng)液制備成的病毒濃縮液去感染正常FG細胞，也出現(xiàn)CPE現(xiàn)象，只是CPE現(xiàn)象推遲了4天，由此證明了新擴增的病毒仍具有侵染力，但其感染力有所下降。
　　綜上所述，本文采用水浸片光鏡觀察、電鏡檢測（負染和病灶組織超薄切片觀察）、弧菌選擇性培養(yǎng)、牙鲆鰓細胞系病變效應(yīng)檢