大菱鲆紅體病虹彩病毒的流行情況調(diào)查及其主要衣殼蛋白在畢赤酵母中的重組表達.pdf

1、自2001年以來由大菱鲆紅體病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus.TRBIV)引發(fā)的大菱鲆病毒性紅體病(viral reddish body syndrome of turbot，VRBS)在我國養(yǎng)殖大菱鲆中的流行日益嚴重，已成為制約著該養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的最嚴重的瓶頸因素之一。 本研究利用已建立的PCR檢測技術(shù)對TRBIV的流行情況進行了調(diào)查，調(diào)查結(jié)果顯示：(1)TRBIV的流行已遍布山

2、東半島沿海地區(qū)，苗期、養(yǎng)成期和親魚期的大菱鲆均可感染TRBIV，VRBS已成為最嚴重的大菱鲆疾病之一。(2)養(yǎng)殖水溫是影響該病發(fā)生的重要因素之一：在養(yǎng)殖水溫高于18℃時，患病魚的死亡率較高、臨床癥狀明顯，3個月內(nèi)的累積死亡率高達90％以上：養(yǎng)殖水溫低于18℃時，病毒主要以潛伏狀態(tài)出現(xiàn)于癥狀不明顯或無明顯臨床癥狀的大菱鲆體內(nèi)，且感染魚的死亡率較低。(3)調(diào)查發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖密度也是加重該病發(fā)生的因素之一，養(yǎng)殖密度偏高時感染魚的死亡率明顯增加。(4

3、)利用TRBIV的PCR檢測技術(shù)，發(fā)現(xiàn)除肌肉外大菱鲆的腦、鰓、心臟、肝臟、消化道、脾臟、腎臟、血液、性腺等均為TRBIV的敏感組織；(5)在大菱鲆親魚的性腺中檢測到TRBIV的存在，因此，TRBIV的垂直傳播途徑需要深入調(diào)查和研究。 本研究還根據(jù)TRBIV主要衣殼蛋白(Major Capsid Protein，MCP)基因的全序列，利用Omiga2.0及Primer Premier5.0軟件對其進行分析并設(shè)計其特異性引物。以本實

4、驗室構(gòu)建的克隆質(zhì)粒pUCm-T/TRBIV MCP為模板，擴增部分為TRBIVMCP全序列中的3 bp到1359 bp之間的區(qū)段(即去除了起始密碼子ATG，終止密碼子TAA后的區(qū)段)，經(jīng)PCR擴增得到一條約為1.4 Kb的特異性條帶，將經(jīng)過酶切后的PCR產(chǎn)物、表達載體pGAPZaA定向連接后電轉(zhuǎn)導于E.coli DH<,5a>(recAlendAl)，經(jīng)過Zeocin<'TM>初篩，PCR和雙酶切檢測，核酸序列測定后確定成功構(gòu)建了重組質(zhì)

5、粒pGAPZaA/TRBIV-MCP。重組質(zhì)粒pGAPZaA/TRBIV MCP經(jīng)Avr Ⅱ酶切線性化后電轉(zhuǎn)導于畢赤酵母X-33中，重組酵母經(jīng)高濃度的Zeocin<'TM>初篩，提取陽性酵母菌的基因組DNA，經(jīng)PCR檢測和鑒定后確定成功構(gòu)建了陽性重組畢赤酵母。對陽性酵母小量發(fā)酵后，取其上清進行SDS-PAGE電泳檢測及用anti-myc-HRP抗體進行Elisa-blot和Westen Blot檢測，均檢測到目的蛋白。另外又對其表達因素