應用豬口腔液進行PRRSV中和抗體監(jiān)測及納米顆粒候選疫苗的評估.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)自1991年被鑒定以來,已經(jīng)成為嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病,目前在世界范圍內(nèi)每年都給養(yǎng)豬業(yè)造成上億經(jīng)濟損失?？谇灰菏且环N唾液和黏膜滲出液的混合物,包含來自血清和唾液腺的抗體。由于采集簡單、費用低廉,用口腔液進行豬場疫病監(jiān)測得到越來越多的應用。
　　PRRSV特異性中和抗體在病毒的清除中發(fā)揮著重要作用,同時也是評估豬群 PRRS免疫保護水平的主要指標。有研究證明可以從豬口腔液樣品中檢測到PRRSV病

2、原和病毒特異性抗體。但是,迄今為止,應用豬口腔液來檢測PRRSV中和抗體仍是空白。因此,本研究旨在建立一種應用豬口腔液進行PRRSV特異性中和抗體檢測的試驗方法。首先進行標準化試驗,口腔液樣品主要來自兩個方面:豬場免疫PRRSV弱毒疫苗(PRRSV-MLV)后為期三個月間斷性采集的口腔液樣品;公豬免疫 PRRSV-MLV或感染PRRSV-MN184當天及第21天采集的口腔液和血清樣品。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)當口腔液中PRRSV中和抗體滴度大于1:

3、8時是病毒特異的,而這種特異性中和抗體只有在免疫或者感染28天后才能從口腔液中檢測到。為了驗證該試驗方法,從一個背景未知的豬場,采集了以欄為單位的口腔液樣品共104份以及每欄有代表性的血清樣品5份;另外,從4個不同育種豬場中,采集重復免疫的母豬血清樣品以及對應母豬產(chǎn)下仔豬的口腔液樣品各100份。檢測結(jié)果顯示,口腔液中的PRRSV中和抗體滴度與血清中和抗體滴度相關(guān),可以從斷奶后仔豬的口腔液樣品中檢測到 PRRSV特異性母源中和抗體。

4、>　　當前現(xiàn)有的PRRSV商品化疫苗均存在不同的弱點,不能對豬群提供完全保護,開發(fā)新型PRRSV疫苗的研究仍在不斷進行。本研究的另外一個目標是探索口腔液在實驗室條件下評估候選疫苗效果時的作用。以二乙烯亞胺(binary ethylenimine, BEI)滅活PRRSV-VR2332病毒,選擇性的將滅活的病毒抗原與荊豆凝集素(Ulex Europaeus Agglutinin, UEA)一起包埋于聚乳酸-聚羥乙酸(poly lactid

5、e-co-glycolide,PLGA)中,制成納米顆粒疫苗,然后將納米顆粒疫苗分別與4種候選佐劑共同免疫實驗動物,經(jīng)2次鼻內(nèi)噴霧接種后,用 PRRSV-MN184進行攻毒試驗以評價疫苗的交叉免疫保護能力。通過對黏膜相關(guān)組織(肺,支氣管淋巴結(jié),支氣管肺泡灌洗液),血清以及口腔液的免疫相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn),第8試驗組滅活 VR2332納米顆粒疫苗與4號佐劑(NP-VR+Adjuvant4)產(chǎn)生的免疫效果較好,實驗動物可以獲得較好的交叉保護,具體

6、表現(xiàn)為:(1)黏膜相關(guān)組織的PRRSV RNA拷貝數(shù)低,攻毒后第9天血清中的PRRSV被完全清除,攻毒后第15天口腔液中病毒RNA檢測結(jié)果陰性;(2)肺和支氣管肺泡灌洗液中檢測到高滴度的PRRSV中和抗體,攻毒后第15天可以在口腔液中檢測到中和抗體;(3)肺和支氣管肺泡灌洗液中 PRRSV特異性 IgG應答顯著增強,血清和口腔液中呈現(xiàn)高水平的IgA和IgG應答。這是應用口腔液樣品與血清等其它樣品一起篩選候選疫苗的首次嘗試,口腔液中的PR

7、RSV RNA拷貝數(shù),中和抗體滴度和特異性IgA和IgG反應等結(jié)果為疫苗的免疫效果評估提供了重要參考價值。
　　本研究建立了一種以豬口腔液為樣品檢測 PRRSV特異性中和抗體的實驗方法,其特異性和重復性分別達到94.3％和90.5%。本研究還通過口腔液中的PRRSV RNA拷貝數(shù),中和抗體滴度和特異性IgA和IgG反應對候選納米顆粒疫苗的免疫效果進行了評估,而這些試驗結(jié)果對于疫苗的免疫效果評價是有效的。因此,豬的口腔液可作為PRR