不同免疫原對(duì)PRRSV誘導(dǎo)中和抗體的影響及SHP1在PRRSV感染中的作用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus，PRRSV)引起的以母豬的繁殖障礙與仔豬的呼吸障礙為特征的病毒性傳染病。PRRSV的一個(gè)重要生物學(xué)特征是對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞(Porcine alveolar macrophage，PAM)

2、具有親嗜性。PRRSV特異性中和抗體在抗PRRSV的免疫保護(hù)中具有重要作用，同時(shí)也是評(píng)估豬群PRRS免疫保護(hù)水平的指標(biāo)。因此建立基于PAMs的抗PRRSV的中和抗體的檢測(cè)方法至關(guān)重要，對(duì)PRRS的防治具有重要意義。
　　SHP1是肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸磷酸酶，可抑制TLR信號(hào)介導(dǎo)的NF-κB和MARK的激活，從而抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。但有研究表明SHP1卻對(duì)TLR和RIG-Ⅰ介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生有激活作用。SHP1可通過相反的

3、方式調(diào)節(jié)促炎性細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。為了研究SHP1在PRRSV誘導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)中的作用，本論文對(duì)PRRSV感染后SHP1介導(dǎo)的信號(hào)通路進(jìn)行了初步研究。
　　本試驗(yàn)為建立一種檢測(cè)豬血清樣品中PRRSV誘導(dǎo)的中和抗體的方法，先將收集的標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行滅活處理，取2倍倍比稀釋后的被檢血清和陰性血清分別與等量病毒液混合，接種到鋪單層的PAM細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收獲樣品，通過用實(shí)驗(yàn)室建立的熒光定量PCR方法測(cè)定收獲樣品的病毒拷貝

4、數(shù)來建立抗PRRSV中和抗體的檢測(cè)方法。為了驗(yàn)證此方法，本研究采集了34份臨床樣品進(jìn)行抗PRRSV的中和抗體檢測(cè)。結(jié)果顯示，本研究建立并驗(yàn)證了基于PAMs的PRRSV誘導(dǎo)的中和抗體的檢測(cè)方法，本方法的特異性、重復(fù)性較好，可用于評(píng)估豬群PRRSV的免疫保護(hù)水平。
　　本研究為了進(jìn)一步評(píng)估豬群PRRS免疫保護(hù)水平，探討了不同免疫原對(duì)PRRSV誘導(dǎo)的中和抗體產(chǎn)生的影響，將28日齡的健康仔豬隨機(jī)分成五組，第一組為弱毒苗免疫組，在0d免疫接

5、種PRRSV CH-1R弱毒苗;第二組為滅活免疫原免疫組，在0d免疫接種PRRSV油乳劑滅活免疫原;第三組為先強(qiáng)毒感染再滅活免疫原免疫組，0d免疫接種PRRSV強(qiáng)毒液，7d后再免疫接種滅活免疫原;第四組為先弱毒感染再滅活免疫原免疫組，0d免疫接種PRRSVCH-1R弱毒株，7d后再免疫按種滅活免疫原;第五組為健康對(duì)照組。用實(shí)驗(yàn)一建立的抗PRRSV的中和抗體的方法對(duì)試驗(yàn)組進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示:第一組在免疫后28d時(shí)3頭豬中有兩頭豬的中和效價(jià)

6、為1∶2，在42的時(shí)3頭豬的中和效價(jià)分別為1∶32，1∶4，1∶16。第二組在免疫后28d時(shí)3頭豬抗PRRSV中和效價(jià)均小于1∶2，在42的時(shí)3頭豬的抗PRRSV的中和效價(jià)分別為1∶4，1∶8，1∶8。第三組強(qiáng)毒感染后3頭豬已表現(xiàn)臨床癥狀，再用滅活免疫原免疫，發(fā)現(xiàn)已表現(xiàn)出臨床癥狀的豬只免疫后，病情更加嚴(yán)重，均未產(chǎn)生中和抗體。第四組先弱毒感染再滅活免疫原免疫，免疫后28d時(shí)有2頭豬中和效價(jià)為1∶2，42d時(shí)有3頭豬均為1∶2。結(jié)果表明單純

7、PRRSV弱毒苗免疫產(chǎn)生中和抗體水平要比PRRSV感染后再用滅活免疫原免疫要高，單純PRRSV油乳劑滅活免疫原免疫產(chǎn)生中和抗體水平要比PRRSV感染后再用滅活免疫原免疫要高，單純PRRSV弱毒苗免疫一次的中和抗體水平要比單純PRRSV油乳劑免疫原免疫一次的要高。推測(cè)PRRSV感染后再用滅活免疫原免疫可能會(huì)增強(qiáng)病毒在豬體內(nèi)的復(fù)制，抑制中和抗體的產(chǎn)生。因此感染過PRRSV的規(guī)模化豬場(chǎng)，不建議使用滅活苗免疫。
　　為了探究SHP1在PR

8、RSV誘導(dǎo)的抗病毒免疫中的作用，本研究采用200個(gè)TCID50的PRRSV感染豬肺巨噬細(xì)胞(porcine alveolar macrophage，PAM)，分別培養(yǎng)12h、24h、36h、48h后收集細(xì)胞及上清，分別設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組、聚肌胞(polyinosinic-polycytidylic acid, polyI∶C)刺激對(duì)照組、脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激對(duì)照組。采用ELISA方法檢測(cè)PRRSV感染

9、的PAM培養(yǎng)上清中SHP1的蛋白表達(dá)情況。用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)PRRSV感染組和各個(gè)對(duì)照組中PRRSV復(fù)制水平及各組PAM細(xì)胞中IRF3、IRF7、TRAF6、NF-κB、SHP1、IFN-β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示:激活的SHP1對(duì)PRRSV感染后PAM中IRF7、NF-kB、IFN-β的轉(zhuǎn)錄有促進(jìn)作用，對(duì)IRF3和TRAF6的轉(zhuǎn)錄有抑制作用。用LPS、Poly(I∶C)刺激PAM細(xì)胞，在12

10、h、24h、36h、48h均能促進(jìn)IRF3、IRF7、TRAF6、NF-κB、SHP1、IFN-β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。LPS刺激PRRSV感染的PAM細(xì)胞促進(jìn)了IRF3、IRF7、TRAF6、NF-κB、SHP1、IFN-β的轉(zhuǎn)錄，Poly(I∶C)刺激PRRSV感染的PAM細(xì)胞也促進(jìn)了IRF3、IRF7、TRAF6、NF-κB、SHP1、IFN-β的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果表明激活的SHP1會(huì)通過TLR介導(dǎo)的信號(hào)通路或未知通路來調(diào)節(jié)PRRSV誘導(dǎo)的