不同類型的PRRSV GP5重組蛋白的表達及其抗體中和活性的分析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductice and Respiratory Syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以母豬繁殖障礙和生長期豬的呼吸道癥狀為特征的高度傳染性疾病，給世界范圍的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。中和抗體在抵抗PRRSV的感染中起到至關重要的作用，PRRSV的GP5蛋白作為病毒囊膜的重要組成部分，被認為是誘導中和抗體的主要蛋白，也較多應用于PRRSV基因工程疫苗

2、的研究。然而以GP5作為目標基因的亞單位疫苗往往不能誘導較高滴度的中和抗體，并且交叉保護性較差，該蛋白在免疫保護中的地位目前也存在一定爭議。因此通過體外高效表達GP5蛋白，并分析其誘導中和抗體的能力，將為探討GP5在PRRSV免疫保護中的作用及其在PRRSV防控中的應用提供一定理論參考。
　　實驗一旨在以原核表達系統(tǒng)表達缺失跨膜區(qū)和信號肽的截短GP5重組蛋白。本研究首先利用Marc-145細胞對實驗室所保存的PRRSV美洲株VR2

3、332進行增殖，通過RT-PCR方法擴增出完整的ORF5基因，連接至PMD18-T載體構建重組質粒PMD18T-ORF5并進行測序。根據(jù)ORF5基因的測序結果，設計兩對引物，其中一對引物用于擴增ORF5基因上編碼N-端多肽的核酸片段(ORF5N)，另一對引物用于擴增ORF5基因上編碼C-端多肽的核酸片段(ORF5C)，采用重疊延伸PCR技術(Gene sphcing by overlap extension PCR，SOE-PCR)對兩

4、個片段進行連接，擴增出缺失跨膜區(qū)(66aa-125aa)和信號肽(1aa-31aa)序列的ORF5基因片段并連接至原核表達載體PET-32a，構建原核表達載體PET-ORF5NC。將重組質粒轉化至大腸桿菌BL21中，經(jīng)IPTG誘導成功表達出大小為31.5KD的GP5重組蛋白，與預期的蛋白大小相符。經(jīng)過對IPTG誘導表達的濃度、時間的優(yōu)化，獲得了重組蛋白的高效表達，以尿素法純化包涵體蛋白并復性，分別以鼠抗His單克隆抗體和PRRSV陽性血

5、清為一抗對重組蛋白進行Western blot檢測，結果顯示重組蛋白可以被鼠抗His單克隆體和PRRSV陽性血清所識別，表明重組蛋白具有良好的反應原性。
　　實驗二旨在以桿狀病毒/昆蟲表達系統(tǒng)表達全長的GP5重組蛋白，并表達缺失跨膜區(qū)、信號肽的截短GP5重組蛋白。根據(jù)實驗一所獲得的OFR5基因片段，再次設計兩對引物，其中一對引物以質粒PMD18T-ORF5為模版，擴增出完整的ORF5基因片段(ORF5);另一對引物以質粒PET-O

6、RF5NC為模版，擴增出缺失跨膜區(qū)、信號肽的ORF5基因片段(ORF5NC)，分別連接至pFastBac-HTA供體質粒，將獲得的兩種重組供體質粒分別轉化含有桿狀病毒穿梭質粒的DH10-Bac細胞，經(jīng)三重抗性和藍白斑篩選，獲得兩種重組穿梭質粒Bacmid-ORF5和Bacmid-ORF5NC。將穿梭質粒分別轉染Sf9細胞，獲得重組桿狀病毒AcMNPV-ORF5和AcMNPV-ORF5NC;將兩種重組桿狀病毒分別感染Sf9細胞，以SDS-

7、PAGE和Western blot對兩種重組桿狀病毒所表達的蛋白進行鑒定，結果表明，Sf9細胞中分別表達了大小約為22KD的全長的GP5重組蛋白和大小為17KD的截短的GP5重組蛋白，與預期的蛋白大小相符并均為非糖基化形式。大量表達重組蛋白，并以Ni柱親和層析方法對兩種重組蛋白進行純化，經(jīng)SDS-PAGE并以ImageJ軟件進行灰度分析，目的蛋白純度均達到90％以上，其中AcMNPV-ORF5表達純化產(chǎn)物為903％，AcMNPV-ORF

8、5NC表達純化產(chǎn)物為92.6％。
　　實驗三旨在探討所獲得的三種GP5重組蛋白誘導PRRSV中和抗體產(chǎn)生的能力。將三種重組蛋白作為免疫原，分別免疫昆明小鼠制備三種抗血清，并分別以各重組蛋白和PRRSV仝病毒作為ELISA包被抗原，檢測抗血清的效價。結果表明，當以各重組蛋白作為ELISA包被抗原檢測自身對應的抗血清時，抗原核表達的截短GP5蛋白抗血清效價為1∶25600，抗真核表達的全長GP5蛋白抗血清效價為1∶12800，抗真核表

9、達的截短GP5蛋白抗血清效價為1∶12800;當以PRRSV全病毒作為ELISA包被抗原檢測抗血清時，抗原核表達的截短GP5蛋白抗血清效價為1∶200，抗真核表達的全長GP5蛋白血清效價為1.800，抗真核表達的截短的GP5蛋白血清效價為1∶1600。以本實驗室已建立的中和試驗方法將獲得的三種抗血清分別在豬肺泡巨噬細胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)進行PRRSV的血清學中和試驗，通過實時定量PCR