HCV中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒的制備及其誘導(dǎo)的中和抗體的初步研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染目前已成為全球性的社會(huì)公共衛(wèi)生問題之一。HCV感染后極易慢性化,發(fā)展為終末期肝病,肝硬化甚至肝癌,對(duì)HCV感染的治療多使用重組α干擾素(interferon-α,IFN-α),或聯(lián)合廣譜抗病毒藥物利巴韋林(ribavirin),但治療效果不佳,有一定的副作用,且不同型別對(duì) IFN反應(yīng)性差別較大。迄今為止,尚未研制出有效的丙肝疫苗,最主要原因是HCV型別多樣,基因高度變異。大多

2、數(shù)的變異與包膜蛋白基因的高變區(qū)有關(guān),研究較多的是E2基因區(qū)的HVR1。HCV感染后能產(chǎn)生多種抗體,只有針對(duì)包膜蛋白的中和抗體才具有保護(hù)作用,因此尋找 E1/E2上的中和抗原表位,尤其是能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生交叉中和作用的中和抗原表位是解決其高變性的有效途徑之一。近些年來,HCV假病毒顆粒(HCV pseudo-particle,HCVpp)、HCV體外培養(yǎng)系統(tǒng)(HCVcc)的建立和應(yīng)用于中和抗體測(cè)定及其評(píng)價(jià)方法的建立,使人們對(duì)HCV中和抗體在機(jī)體

3、適應(yīng)性免疫中的作用,尤其是交叉保護(hù)作用認(rèn)識(shí)逐漸深入。誘導(dǎo)廣譜交叉保護(hù)作用中和抗體的HCV疫苗研究將成為新的熱點(diǎn)。
　　本研究通過構(gòu)建嵌合中和抗原表位的表達(dá)載體,利用乙肝小包膜蛋白(HBsAg-S)能夠自我裝配及攜帶外源性抗原的特點(diǎn),制備病毒樣顆粒,并對(duì)其進(jìn)行鑒定;經(jīng)純化、濃縮后免疫小鼠,觀察小鼠體內(nèi)中和抗體產(chǎn)生情況,為設(shè)計(jì)HCV中和抗體疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。
　　1.HCV中和抗原表位與HBV S抗原嵌合基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒的

4、構(gòu)建及其在293T細(xì)胞中的表達(dá)
　　目的：構(gòu)建HCV中和抗原表位與HBV S抗原嵌合基因重組表達(dá)載體并證實(shí)其在真核細(xì)胞中的表達(dá)。
　　方法：通過查閱文獻(xiàn),選擇三個(gè)HCV E1和E2區(qū)保守的線性中和抗原表位,以及一個(gè)針對(duì) HVR1的模擬表位,確定其氨基酸序列分別為ITGHRMAWDMMMNWS,QLINTNGSWHIN,GVPTYSWGENET,ETYVSGGSAARNAYGLTSLFTVGPAQK。擴(kuò)增HBV S抗原基因,在

5、HBV S親水區(qū)127和128位氨基酸序列處引入Age I酶切位點(diǎn)。將表位基因分別插入該位點(diǎn),構(gòu)建嵌合的重組HBV S基因,再將該基因克隆至真核表達(dá)載體pCI-neo中,構(gòu)建重組的真核表達(dá)載體pCI-HBSEm(pCI-HBSE1-4)。瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切的重組載體進(jìn)行鑒定證實(shí)各條帶大小與預(yù)期相符。轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行真核表達(dá)。
　　結(jié)果：間接免疫熒光分析(indirect immunofluorescence assay,IF

6、A)顯示,四種嵌合質(zhì)粒 pCI-HBSEm(pCI-HBSE1-4)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后在胞漿內(nèi)能夠觀察到明顯的綠色熒光,而非重組載體 pCI-neo作為陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞包漿內(nèi)則未觀察到明顯綠色熒光;western blot法對(duì)嵌合質(zhì)粒pCI-HBSEm轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的裂解液進(jìn)行鑒定,可見相對(duì)分子質(zhì)量約27KD處的蛋白條帶,而pCI-neo轉(zhuǎn)染細(xì)胞后未見此條帶。
　　結(jié)論：以上陽(yáng)性結(jié)果表明重組真核表達(dá)載體pCI-HBS

7、Em構(gòu)建成功,并在293T細(xì)胞中能夠進(jìn)行有效表達(dá)。
　　2.HCV中和抗原表位與HBV S抗原嵌合病毒樣顆粒的制備及鑒定
　　目的：制備HCV中和抗原表位與HBV S抗原嵌合病毒樣顆粒并對(duì)其進(jìn)行鑒定。
　　方法：293T細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)至90％密度時(shí),將構(gòu)建的HCV中和抗原表位與HBV S抗原嵌合重組真核表達(dá)載體pCI-HBSEm用脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,得到自我裝配的嵌合HCV中和表位

8、的HBV病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)。為了純化VLPs,分9層配制梯度為20%-60%的蔗糖溶液進(jìn)行密度梯度離心,通過電化學(xué)發(fā)光法對(duì)離心后每層溶液進(jìn)行HBsAg定量測(cè)定,檢測(cè)到富集的VLPs,該層即為分離的VLPs片段。大量收集該片段進(jìn)行透析后,用離心濃縮管進(jìn)行濃縮,電鏡分析進(jìn)行鑒定。通過HBsAg的測(cè)定對(duì)純化的VLPs進(jìn)行定量,并與商品化的乙肝疫苗濃度進(jìn)行比較。 結(jié)果：重組真核表達(dá)載體pCI-H

9、BSEm轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞制備出嵌合HCV中和表位的HBV VLPs,經(jīng)純化濃縮后在電鏡下可見大小約22nm的球形顆粒,與報(bào)道中HBsAg-S蛋白形成的亞病毒顆粒吻合。HBsAg定量結(jié)果均值最高達(dá)到5.51×103ng/ml。純化的VLPs作為包被抗原能夠檢測(cè)到部分HCV感染患者體內(nèi)存在一定量的中和抗體。
　　結(jié)論：我們成功制備出嵌合HCV中和抗原表位的HBV VLPs,且純化、濃縮后的VLPs達(dá)到較高的濃度水平,可與某些HCV患者

10、血清產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)。并能滿足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物免疫要求,為進(jìn)一步分析誘導(dǎo)的中和抗體研究奠定基礎(chǔ)。
　　3.HCV中和抗原表位與HBV S抗原嵌合病毒樣顆粒免疫小鼠中和抗體的檢測(cè)
　　目的：HCV中和抗原表位與HBV S抗原嵌合病毒樣顆粒免疫小鼠并對(duì)其抗血清中和抗體的產(chǎn)生情況進(jìn)行檢測(cè)分析。
　　方法：將42只雄性BLAB/c小鼠隨機(jī)分為7組,每組6只。每組注射相應(yīng)抗原/佐劑混合物,按照所注射的抗原分別命名為 VLPs-H

11、BSE1、VLPs-HBSE2、VLPs-HBSE3、VLPs-HBSE4、VLPs-pools、VLPs-S、Adjuvant(Adj)。前四組每只小鼠分別注射相應(yīng)的0.3ml500ng VLPs和0.3ml佐劑混合物共0.6ml;VLPs-pools組每只小鼠注射0.3ml四種VLPs等量混合物共500ng和0.3ml佐劑的油包水產(chǎn)物;VLPs-HBs組每只小鼠注射0.3ml500ng VLPs-HBs和0.3ml佐劑混合物共0.6

12、ml;Adj組每只小鼠注射佐劑0.6ml。共免疫三次,每次間隔14天,第一次免疫佐劑用完全弗氏佐劑,第二、三次用不完全弗氏佐劑。自第一次免疫之日起尾靜脈采血100μl/只,每隔14天采血一次,至第70天共采血6次。采集全血離心后分離血清-20℃保存,用于抗血清中和抗體檢測(cè)分析。ELISA法分別以E1-E4四種交聯(lián)抗原肽、交聯(lián)肽的混合溶液、HbsAg陽(yáng)性患者血清作為包被抗原對(duì)免疫小鼠抗血清進(jìn)行檢測(cè),測(cè)量 OD值隨采血時(shí)間推移其中和抗體的產(chǎn)