HCV多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒的制備和免疫血清中和抗體評(píng)價(jià).pdf

1、丙型肝炎病毒（HCV）感染是引起慢性肝臟疾病的主要病因之一，全球估計(jì)有1.8億人感染HCV，而在我國(guó)感染人數(shù)已超過(guò)4000萬(wàn)。50％-85%的HCV感染患者早期無(wú)癥狀，由于HCV病毒生物學(xué)特性、宿主免疫功能等多種因素造成機(jī)體免疫系統(tǒng)難以有效的清除病毒，易發(fā)展為慢性感染。隨著感染的持續(xù)存在可能會(huì)出現(xiàn)肝功能衰竭等一系列表現(xiàn)，甚至是肝硬化和肝癌。因此HCV感染是我們面臨的嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。目前HCV的標(biāo)準(zhǔn)治療方案是聚乙二醇干擾素α（PE

2、G-IFN-α）和利巴韋林聯(lián)合治療，其有效率為40%-60%，費(fèi)用昂貴，副作用較大，且針對(duì)HCV不同型別的持續(xù)病毒應(yīng)答率（SVR）也有差別。近年來(lái)國(guó)外研制經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市的NS3/NS4A蛋白酶抑制劑Simeprevir和NS5B聚合酶抑制劑Sofosbuvir雖然SVR達(dá)到95%-100%，但是價(jià)格極其昂貴，僅針對(duì)1型效果較好，限制了其推廣。因此HCV疫苗是預(yù)防丙肝和緩解其帶來(lái)的沉重社會(huì)負(fù)擔(dān)的最經(jīng)濟(jì)，最有效的醫(yī)學(xué)手段。由于HCV基因組

3、高度變異，尤其是其包膜蛋白存在高變區(qū)，同時(shí)缺乏合適的HCV體外病毒培養(yǎng)系統(tǒng)和小動(dòng)物模型，以及中和抗體評(píng)價(jià)方法的不足，導(dǎo)致HCV預(yù)防疫苗的研制困難重重，至今未能取得突破。
　　感染HCV后，病毒的核心蛋白、包膜蛋白以及非結(jié)構(gòu)蛋白都可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體。然而這些蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體中，只有針對(duì)包膜蛋白E1、E2的中和抗體，才有保護(hù)作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)包膜蛋白的單抗具有廣譜交叉中和活性，與HCV急性感染轉(zhuǎn)歸有關(guān)。因此，尋找包膜蛋白上

4、保守的中和表位，通過(guò)其廣譜交叉中和活性產(chǎn)生的抗體發(fā)揮作用，是研究預(yù)防性疫苗的新思路。同時(shí)，隨著HCV假病毒顆粒（HCVpp）和HCV體外復(fù)制培養(yǎng)系統(tǒng)（HCVcc）研究中和抗體方法的建立和成熟，為預(yù)防疫苗的研制帶來(lái)了希望。
　　本研究結(jié)合HCV中和表位最新的研究進(jìn)展，將具有廣譜交叉活性的中和抗原表位串聯(lián)，把串聯(lián)表位嵌合在HBVS抗原的氨基端胞外區(qū)，利用HBVS抗原具有自我裝配成VLPs以及攜帶外源性抗原的能力，制備了嵌合HCV串聯(lián)多

5、中和表位的HCV-HBV病毒樣顆粒（VLPs）；同時(shí)用同樣方法制備了嵌合HCV包膜蛋白E2的VLPs。對(duì)兩種病毒樣顆粒進(jìn)行鑒定、純化、濃縮后免疫新西蘭兔，檢測(cè)兩種 VLPs誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的情況和水平上的差異，同時(shí)制備了用于評(píng)價(jià)中和抗體作用的1b、2a型HCVpp，觀察兔免疫血清對(duì)HCVpp感染Huh-7.5細(xì)胞的抑制作用，為進(jìn)一步研究HCV預(yù)防疫苗研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的
　　構(gòu)建HCV串聯(lián)多中和表位與HBVS抗原嵌合基因

6、真核表達(dá)質(zhì)粒，在293T細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)；制備嵌合HCV串聯(lián)多中和表位和HCV包膜蛋白E2的兩種HCV-HBV病毒樣顆粒（VLPs），鑒定后免疫新西蘭兔，并對(duì)獲得的兔免疫血清中抗體的水平進(jìn)行分析，進(jìn)而觀察其對(duì)HCVpp感染Huh-7.5細(xì)胞的抑制作用。
　　方法
　　1．將HCV中高度保守同時(shí)有廣譜交叉活性的三個(gè)中和表位與一個(gè)HVR1模擬表位串聯(lián)。把串聯(lián)表位嵌合于HBV S基因的氨基端胞外區(qū)，形成嵌合基因MEpS，克隆到真核載

7、體pCI-neo中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCI-MEpS；擴(kuò)增HCV E2基因，用同樣的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pCI-E2S。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，間接免疫熒光及Western blot檢測(cè)嵌合基因的表達(dá)情況。
　　2.重組質(zhì)粒pCI-MEpS和pCI-E2S轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，3天后收集培養(yǎng)細(xì)胞的上清，Amicon Ultracell-15100K離心過(guò)濾器濃縮離心，獲得濃縮的VLPs。通過(guò)蔗糖密度梯度離心（25%-60%）純化VLPs，通

8、過(guò)對(duì)離心后每一層蔗糖溶液的HBsAg定量測(cè)定，收集高濃度片段，得到富集VLPs。透析除去蔗糖，再濃縮后得到純化的病毒樣顆粒。Western blot和電鏡分析鑒定VLPs。
　　3.將18只新西蘭兔分為六組，每組3只。分別命名為VLPs-MEpS，VLPs-E2S，VLPs-HBS，Vaccine，Adjuvant（MF59），PBS。純化的10?g的VLPs與佐劑MF59混合成油包水狀后，皮下注射免疫新西蘭兔；商品化的乙肝疫苗，

9、佐劑和PBS作為對(duì)照。一共免疫三次，每次間隔兩周。不同時(shí)間點(diǎn)留取兔血清，間隔兩周，分裝后-20℃保存。以合成多肽為包被抗原，ELISA法檢測(cè)收集的血清內(nèi)抗體的水平和差異。
　　4.構(gòu)建1b、2a型的HCVpp，確定轉(zhuǎn)導(dǎo)單位。將三種不同 HCV假病毒包裝質(zhì)粒：HCV包膜質(zhì)粒pVRC-E1E2（1b、2a型），包裝質(zhì)粒pHR′CMVΔ8.2及轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-CG按照3μg:6μg:9μg（每75cm2培養(yǎng)瓶）轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，分別在4

10、8h和72h時(shí)通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后 EGFP表達(dá)情況，并各收獲一次細(xì)胞上清。收獲的上清7000rpm，4℃離心10min；0.45μm濾器過(guò)濾；離心過(guò)濾器（Amicon Ultracell-100K）濃縮離心，得到濃縮的HCV假病毒顆粒（HCVpp）。Western blot鑒定得到的假病毒顆粒中HCV E1、E2的表達(dá)。HCVpp不同稀釋度轉(zhuǎn)染2.0×105Huh7.5細(xì)胞，根據(jù)不同稀釋度下流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)的EGFP陽(yáng)性細(xì)胞比率計(jì)算

11、HCVp p的感染轉(zhuǎn)導(dǎo)單位（TU）。以EGFP陽(yáng)性率達(dá)到50%為最佳稀釋濃度。TU計(jì)算方法：TU/ml=（初始靶細(xì)胞數(shù)/HCVpp ml體積）×（EGFP陽(yáng)性細(xì)胞的百分率/100）。將不同稀釋度的兔免疫血清與合適轉(zhuǎn)導(dǎo)單位的HCVpp混合，室溫孵育1h，加入1.0×105Huh7.5細(xì)胞。48~72h后流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)表達(dá) EGF P的陽(yáng)性細(xì)胞比率，PBS免疫血清為非抑制對(duì)照。計(jì)算中和抗體中和率（抑制率%），計(jì)算方法：中和率=（%EGFP對(duì)

12、照組-%EGFP實(shí)驗(yàn)組）/%EGFP對(duì)照組。
　　結(jié)果
　　1.瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR擴(kuò)增出預(yù)期的截短的HBS、MEp和HCV E2片段，大小分別為666bp，255bp，1092bp，T-easy連接后測(cè)序正確。酶切后pCI-neo、截短的HBS、MEp（或HCV E2）三片段過(guò)夜連接，酶切鑒定pCI-MEpS、pCI-E2S分別得到大小為921bp、1758bp的片段。間接免疫熒光顯示pCI-MEp S和pCI-E2S

13、轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞胞漿內(nèi)相比于對(duì)照組可見(jiàn)較強(qiáng)的綠色熒光。Western blot顯示pCI-MEpS在相對(duì)分子量約35kDa，38k Da（糖基化后）處可見(jiàn)蛋白條帶，pCI-E2S在相對(duì)分子量65kDa，97kDa（糖基化后）處可見(jiàn)蛋白條帶。
　　2.重組質(zhì)粒pCI-MEpS、pCI-E2S轉(zhuǎn)染293T制備VLPs，濃縮收集的上清經(jīng)Western blot鑒定，VLPs- MEpS在約38kDa處、VLPs-E2S在約97kDa處

14、可見(jiàn)蛋白條帶。純化濃縮VLPs負(fù)染電鏡下觀察可見(jiàn)大小22nm左右的球形顆粒。HBsAg定量測(cè)定濃度可達(dá)30×103ng/ml。
　　3.ELISA法檢測(cè)兔免疫血清中抗體的水平。OD值結(jié)果顯示VLPs-MEpS組和VLPs-E2S組相比對(duì)照組明顯檢測(cè)到血清中的抗體，VLPs-MEpS組高于 VLPs-E2S組。
　　4.1b、2a型的HCVpp的包裝，48 h、72 h熒光顯微鏡下均可見(jiàn)到明顯的熒光。收集培養(yǎng)上清，過(guò)濾濃縮，W

15、estern b lot顯示在相對(duì)分子量約35 k Da、58kDa處可見(jiàn)蛋白條帶。一定轉(zhuǎn)導(dǎo)單位的1b型HCVpp與兔免疫血清混合后感染Huh7.5細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫血清中抗體對(duì)HCVpp感染Huh7.5具有一定的抑制作用，抑制作用在42天達(dá)到高峰，VLPs-MEpS組高于VLPs-E2S組。
　　結(jié)論
　　成功構(gòu)建了嵌合HCV串聯(lián)多中和表位和HCV包膜蛋白E2的乙肝S抗原真核載體表達(dá)質(zhì)粒，并在293 T細(xì)胞中表達(dá)。成功制備