葡萄球菌誘導(dǎo)斑馬魚皮膚免疫相關(guān)基因差異表的的研究.pdf

1、魚類皮膚黏膜是黏膜免疫系統(tǒng)的重要組成部分,越來越多的研究表明魚類皮膚黏膜可獨(dú)立完成抗原攝取、遞呈及分泌抗體等功能,在魚類抵抗外來病原侵襲方面發(fā)揮著極其重要的作用,但其在免疫應(yīng)答過程中表達(dá)的免疫相關(guān)基因目前尚不完全清楚。本研究的總體思路是利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)經(jīng)致死劑量產(chǎn)色葡萄球菌處理和未處理的斑馬魚(Danio rerio)皮膚,檢測(cè)和分析感染后斑馬魚免疫應(yīng)答早期皮膚組織差異表達(dá)基因,以挖掘出斑馬魚皮膚免疫早期相關(guān)功能基因的詳實(shí)數(shù)據(jù)信息,

2、為研究魚類皮膚黏膜的免疫機(jī)制和研發(fā)浸泡免疫疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　首先,從草魚腸道分離鑒定致病性產(chǎn)色葡萄球菌,為后續(xù)試驗(yàn)提供菌種。采用常規(guī)細(xì)菌分離培養(yǎng)方法結(jié)合人工感染試驗(yàn)從草魚腸黏膜分離獲得一株致病菌,命名為SC1菌株。根據(jù)其染色特性和菌落特征進(jìn)行初步鑒定;然后采用分子生物學(xué)方法,對(duì)其16SrRNA基因和過氧化氫酶基因(kat)進(jìn)行擴(kuò)增和序列分析。結(jié)果表明,該菌為G+球菌,呈葡萄串狀排列,無莢膜和芽孢,其生化特性等與葡萄球菌屬(Sta

3、phylococcus)相吻合,分離菌株16SrRNA基因和kat基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別為1520bp和1232bp,序列分析分析表明它們?cè)谶z傳距離上與產(chǎn)色葡萄球菌(Staphylococcus chromogenes)最為接近,從而SC1菌株為產(chǎn)色葡萄球菌。
　　其次,建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物斑馬魚的感染模型。以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,感染劑量、時(shí)間為參數(shù),進(jìn)行產(chǎn)色葡萄球菌人工感染斑馬魚試驗(yàn),通過觀察感染后斑馬魚的發(fā)病死亡情況以及組織病理學(xué)變化,

4、確定其最佳感染條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以108CFU/mL菌液濃度浸泡感染10min后斑馬魚的活動(dòng)狀態(tài)比較一致,出現(xiàn)了游動(dòng)緩慢和浮頭現(xiàn)象,并且死亡時(shí)間相對(duì)較為集中。病理學(xué)變化主要表現(xiàn)為腎臟細(xì)胞壞死、核內(nèi)染色質(zhì)濃縮、染色加深并伴有炎癥細(xì)胞浸潤;肝臟細(xì)胞排列疏松、染色加深、伴有炎癥細(xì)胞浸潤。由此可見,該感染條件是產(chǎn)色葡萄球菌人工感染斑馬魚的最佳條件。
　　最后,以斑馬魚感染模型為研究對(duì)象,利用基因芯片技術(shù)從皮膚組織中抽提總RNA,經(jīng)生物素(Bi

5、otin)標(biāo)記后,與包含15617個(gè)cDNA探針的斑馬魚表達(dá)譜基因芯片雜交,在斑馬魚免疫應(yīng)答早期,檢測(cè)皮膚免疫相關(guān)差異表達(dá)基因,并進(jìn)行功能聚類、注釋分析和通路分析。結(jié)果共檢測(cè)出272個(gè)差異表達(dá)基因,其中210個(gè)為上調(diào)表達(dá)基因,62個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。利用NCBI、MAS等數(shù)據(jù)庫對(duì)差異基因進(jìn)行功能聚類和注釋分析,結(jié)果顯示272個(gè)差異表達(dá)基因中,134個(gè)為已知功能基因,具有免疫功能的基因有10個(gè),主要包括凝集素基因(lgals1l3)、組織相容

6、性復(fù)合體(mhc1uea、mhc1ufa)、谷胱甘肽氧化物酶基因(gpx1b)、轉(zhuǎn)鐵蛋白基因(tfa)、凝血因子(f5)、硒蛋白基因(sepw2b)、補(bǔ)體(cfb)(均為上調(diào)表達(dá));腫瘤壞死因子基因(tnfsf10l4)和卵黃蛋白原基因(vtg3)(均為下調(diào)表達(dá))。它們涉及的免疫反應(yīng)包括病原體識(shí)別、抗原加工與提呈、補(bǔ)體激活和特異性免疫應(yīng)答。通路分析結(jié)果顯示p53信號(hào)通路、ErbB受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等9個(gè)通路均