B型單端孢霉烯族毒素誘導(dǎo)拒食和嘔吐的機(jī)理研究.pdf

1、B型單端孢霉烯族毒素是由鐮刀菌產(chǎn)生的一組單端孢霉烯族真菌毒素，廣泛污染小麥、大麥、玉米等谷物及其產(chǎn)品。這類(lèi)毒素具有多種毒性作用，能夠?qū)е戮苁?、嘔吐、惡心、生長(zhǎng)遲滯、神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂和免疫抑制等，嚴(yán)重威脅動(dòng)物和人類(lèi)健康。特別是拒食和嘔吐，涉及嚴(yán)重的食源性中毒問(wèn)題。然而，B型單端孢霉烯族毒素誘導(dǎo)拒食和嘔吐反應(yīng)的劑量和機(jī)理尚不清楚。B型單端孢霉烯族毒素包括5種毒素:(1)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON);(2)3-乙酰

2、基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-acetyldeoxynivalenol，3-ADON);(3)15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-acetyldeoxynivalenol，15-ADON);(4)鐮刀菌酮-X(Fusarenon X，F(xiàn)X);(5)雪腐鐮刀菌烯醇(Nivalenol，NIV)。本研究以這5種毒素為研究對(duì)象，建立了小鼠急性拒食模型;以DON為代表毒素，從迷走神經(jīng)和促炎性細(xì)胞因子等方面著手，探索了DON誘導(dǎo)拒食反應(yīng)的機(jī)理;比較

3、研究了B型單端孢霉烯族毒素誘導(dǎo)拒食反應(yīng)的量效關(guān)系和持續(xù)時(shí)間，制定了B型單端孢霉烯族毒素誘導(dǎo)拒食反應(yīng)的最大無(wú)作用劑量(No observedadverse effect，NOAEL)和最小有作用劑量(Lowest observed adverse effect，LOAEL);建立了水貂急性嘔吐模型，比較研究了B型單端孢霉烯族毒素誘導(dǎo)嘔吐反應(yīng)的量效關(guān)系，嘔吐發(fā)生率，潛伏期和持續(xù)時(shí)間，制定了B型單端孢霉烯族毒素誘導(dǎo)嘔吐反應(yīng)的NOAEL和LOA

4、EL，以及半數(shù)致嘔吐量(50％ emetic dose，ED50);并以DON為代表毒素，從神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(Serotonin，5-HT)，神經(jīng)肽肽YY(Peptide YY，PYY)和膽囊收縮素(Cholecystokinin，CCK)的調(diào)控作用著手，探索了DON誘導(dǎo)嘔吐反應(yīng)的機(jī)理。
　　 試驗(yàn)Ⅰ：小鼠急性拒食模型的建立及DON誘導(dǎo)小鼠拒食反應(yīng)的機(jī)理研究
　　 應(yīng)用B6C3F1雌性小鼠建立了一種急性拒食模型，分別通

5、過(guò)腹腔注射和灌胃攻毒DON(劑量范圍0-5 mg·kg-1)，然后測(cè)定小鼠攻毒后16h內(nèi)的采食量，研究了DON誘導(dǎo)拒食反應(yīng)的量效關(guān)系，持續(xù)時(shí)間和耐受性。應(yīng)用迷走神經(jīng)切斷術(shù)，研究了迷走神經(jīng)在DON誘導(dǎo)的拒食反應(yīng)中所起的作用。采用DON誘導(dǎo)拒食反應(yīng)的NOAEL(2.5mg·kg-1)對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃攻毒，對(duì)照組灌胃PBS，并在攻毒0，2和6h后取小鼠脾臟，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)檢測(cè)DON對(duì)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素I

6、L-1β和IL-6的mRNA基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明:DON能夠誘導(dǎo)急性拒食反應(yīng)，腹腔注射或灌胃攻毒后2h就會(huì)發(fā)生明顯的拒食反應(yīng)，并且具有劑量依賴(lài)性。腹腔注射攻毒時(shí)，DON誘導(dǎo)拒食反應(yīng)的NOAEL和LOAEL分別為0.5和1 mg·kg-1，而灌胃攻毒時(shí)分別為1和2.5 mg·kg-1。DON誘導(dǎo)的拒食反應(yīng)是短暫的，當(dāng)給予1 mg·kg-1DON時(shí)，拒食反應(yīng)持續(xù)3 h;而給予5 mg·kg-1DON時(shí)，拒食反應(yīng)持續(xù)6h。攻毒后2-16

7、h，DON又能夠誘導(dǎo)促進(jìn)食欲反應(yīng)，并且也呈劑量依賴(lài)性。48 h重復(fù)進(jìn)行DON攻毒會(huì)對(duì)其誘導(dǎo)的拒食反應(yīng)產(chǎn)生輕微的耐受作用。但是7d重復(fù)進(jìn)行DON攻毒卻不會(huì)產(chǎn)生耐受，說(shuō)明這種輕微的耐受作用是可逆轉(zhuǎn)的。而切斷迷走神經(jīng)對(duì)DON誘導(dǎo)的拒食反應(yīng)無(wú)顯著影響，說(shuō)明DON誘導(dǎo)的拒食反應(yīng)不涉及迷走神經(jīng)通路。DON能夠上調(diào)脾臟中IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)，灌胃攻毒后2h，IL-1β和IL-6的表達(dá)達(dá)到峰值;而攻毒6h后，IL-1β和IL-6 mRNA

8、的表達(dá)回到基礎(chǔ)水平，說(shuō)明DON誘導(dǎo)的急性拒食反應(yīng)與脾臟中IL-11β和IL-6 mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)。
　　 試驗(yàn)Ⅱ：B型單端孢霉烯族毒素誘導(dǎo)小鼠拒食反應(yīng)的比較研究
　　 應(yīng)用上一章建立的小鼠急性拒食模型，分別通過(guò)腹腔注射和灌胃攻毒(劑量范圍0-5 mg·kg-1)，然后測(cè)定小鼠攻毒后16h內(nèi)的采食量，研究了B型單端孢霉烯族毒素中的3-ADON、15-ADON、FX和NIV誘導(dǎo)的拒食反應(yīng)，并與DON誘導(dǎo)的拒食反應(yīng)進(jìn)行了

9、比較。結(jié)果表明:與DON相似，腹腔注射和灌胃攻毒3-ADON和15-ADON誘導(dǎo)的拒食反應(yīng)是急性的，短暫的，攻毒后2h就會(huì)發(fā)生明顯的拒食反應(yīng)，并且具有劑量依賴(lài)性，但是僅僅持續(xù)數(shù)小時(shí)，攻毒后16h，食欲恢復(fù)正常。腹腔注射攻毒時(shí)，3-ADON和15-ADON誘導(dǎo)拒食反應(yīng)的NOAEL和LOAEL分別為0.5和1 mg·kg1，而灌胃攻毒時(shí)分別為1和2.5 mg·kg-1。與之不同的是，腹腔注射或灌胃攻毒FX和NIV能夠誘導(dǎo)急性的，持續(xù)性的拒食

10、反應(yīng)，反應(yīng)能夠持續(xù)48-96 h。FX腹腔注射和灌胃攻毒的NOAEL都是0.025 mg·kg-1，而LOAEL都是0.25 mg·kg-1bw。而NIV在腹腔注射攻毒時(shí)的NOAEL和LOAEL分別為0.01和0.1 mg·kg-1，灌胃攻毒時(shí)分別為0.1和1 mg·kg-1。以上結(jié)果說(shuō)明，腹腔注射攻毒B型單端孢霉烯族毒素誘導(dǎo)的拒食反應(yīng)強(qiáng)于灌胃。根據(jù)NOAEL和LOAEL，B型單端孢霉烯族毒素誘導(dǎo)拒食反應(yīng)的毒性順序?yàn)?NIV＞FX＞DO

11、N≈3-ADON≈15-ADON(腹腔注射);FX＞NIV＞DON≈3-ADON≈15-ADON(灌胃)。
　　 試驗(yàn)Ⅲ：水貂急性嘔吐模型的建立及B型單端孢霉烯族毒素誘導(dǎo)水貂嘔吐反應(yīng)的比較研究
　　 建立了一種水貂急性嘔吐模型，分別通過(guò)腹腔注射和灌胃攻毒(劑量范圍0-1mg·kg-1)，監(jiān)測(cè)了B型單端孢霉烯族毒素DON、15-ADON、3-ADON、FX和NIV誘導(dǎo)嘔吐反應(yīng)的潛伏期、持續(xù)時(shí)間、發(fā)生率和反應(yīng)強(qiáng)度，比較了5種

12、毒素誘導(dǎo)嘔吐反應(yīng)的能力。并應(yīng)用SAS等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析得到了B型單端孢霉烯族毒素誘導(dǎo)嘔吐反應(yīng)的NOAEL、LOAEL和ED50。結(jié)果表明:B型單端孢霉烯族毒素能夠誘導(dǎo)急性短暫的嘔吐反應(yīng)，攻毒后幾十分鐘就會(huì)發(fā)生反應(yīng)，持續(xù)數(shù)小時(shí)，并具有劑量依賴(lài)性。隨著劑量的增加，嘔吐反應(yīng)的潛伏期會(huì)縮短，持續(xù)時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)，發(fā)生率和反應(yīng)強(qiáng)度會(huì)增高。腹腔注射攻毒，DON，F(xiàn)X和NIV的NOAEL和LOAEL分別為0.05和0.1mg·kg-1，而15-ADON和3-

13、ADON的NOAEL都是0.1 mg·kg-1，LOAEL分別為0.25和0.2 mg·kg-1。灌胃攻毒，DON和FX的NOAEL和LOAEL分別是0.01和0.05mg·kg-1，15-ADON的NOAEL和LOAEL分別是0.01和0.1 mg·kg-1，3-ADON的NOAEL和LOAEL分別是0.05和0.25 mg·kg-1，NIV的NOAEL和LOAEL分別是0.1和0.25 mg·kg-1。腹腔注射攻毒，DON、15-A

14、DON、3-ADON、FX和NIV的ED50分別為80，170，180，70，and60μg·kg-1;而灌胃攻毒DON、15-ADON、3-ADON、FX和NIV的ED50分別為30，40，290，30 and250μg·kg-1。參照NOAEL、LOAEL和ED50，B型單端孢霉烯族毒素誘導(dǎo)嘔吐反應(yīng)的毒性順序?yàn)?NIV≈FX≈DON＞15-ADON≈3-ADON(腹腔注射);DON≈FX≈15-ADON＞NIV＞3-ADON(灌胃)

15、。
　　 試驗(yàn)Ⅳ：DON誘導(dǎo)水貂嘔吐反應(yīng)的機(jī)理研究
　　 應(yīng)用上一章建立的水貂急性嘔吐模型，研究5-HT3受體拮抗劑格拉司瓊(Granisetron，GRA)、Y2受體拮抗劑JNJ-31020028和CCK1受體拮抗劑地伐西匹(Devezepide，DEV)對(duì)DON誘導(dǎo)嘔吐反應(yīng)的阻斷作用，探索DON誘導(dǎo)嘔吐反應(yīng)的通路。然后，分別采用DON誘導(dǎo)嘔吐反應(yīng)的LOAEL和100％致嘔吐劑量0.1和0.25mg·kg-1對(duì)水貂進(jìn)行

16、腹腔注射攻毒，對(duì)照組腹腔注射PBS，分別在攻毒后15，30，60和120 min采血，應(yīng)用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定外周血中DON的含量、神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、神經(jīng)肽PYY和CCK的表達(dá);同時(shí)監(jiān)測(cè)水貂在0-120 min內(nèi)的嘔吐反應(yīng)。結(jié)果表明:在嘔吐拮抗劑試驗(yàn)中，CCK1受體拮抗劑DEV對(duì)DON誘導(dǎo)的嘔吐反應(yīng)無(wú)明顯阻斷作用;Y2受體拮抗劑JNJ-31020028能夠顯著減弱DON誘導(dǎo)的嘔吐反應(yīng);而5-HT3受體拮抗劑GRA既能夠徹底阻斷DON

17、誘導(dǎo)的嘔吐反應(yīng)，也能夠部分阻斷PYY誘導(dǎo)的嘔吐反應(yīng)。外周血中DON的濃度在15-30 min達(dá)到峰值，然后迅速下降，在120 min時(shí)回到基礎(chǔ)水平;DON能夠上調(diào)外周血中5-HT和PYY的表達(dá)，并且具有劑量依賴(lài)性。DON腹腔注射攻毒后60 min，外周血中5-HT和PYY的濃度達(dá)到峰值，而攻毒后120 min，外周血中5-HT和PYY的濃度回到基礎(chǔ)水平。外周血中PYY的濃度在30 min時(shí)開(kāi)始升高，而5-HT在30 min時(shí)沒(méi)有明顯變化