灰葡萄孢菌和紫外誘導(dǎo)葡萄抗毒素白藜蘆醇合成及代謝的研究.pdf

1、葡萄是一種具有重要經(jīng)濟價值的水果，葡萄和葡萄酒中營養(yǎng)成分豐富。葡萄灰霉病是葡萄生產(chǎn)和貯藏中的重要病害之一，可導(dǎo)致葡萄減產(chǎn)15％～50％左右，嚴(yán)重時甚至絕產(chǎn)。近年來，生產(chǎn)上主要防治措施為化學(xué)農(nóng)藥防治、選育抗病品種以及生物防治等，但是由于易造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留、耐藥性、耗時長、穩(wěn)定性差以及防效低等問題，因此通過提高葡萄自身免疫水平或鈍化或抑制病原菌的活性以抵抗病原菌為害的優(yōu)勢越發(fā)突出。
　　白藜蘆醇是葡萄遇到病原菌侵染或逆境時產(chǎn)生的

2、一類特殊的抗毒素，研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇的含量與葡萄對病原菌或逆境脅迫的抗性呈正相關(guān)，因此目前白藜蘆醇被公認為葡萄抗病程度的重要指標(biāo)之一。除白藜蘆醇外，其代謝產(chǎn)物也與葡萄抗病性有關(guān)，據(jù)報道，白藜蘆醇的糖基化產(chǎn)物piceid幾乎無抗菌能力，但其氧化產(chǎn)物二聚體viniferin的抗菌能力更強，但是關(guān)于其代謝物viniferin的機制研究的較少。漆酶是灰霉菌產(chǎn)生的一類重要致病蛋白，具有將白藜蘆醇氧化成viniferin的能力，其漆酶的產(chǎn)量及活性與

3、灰霉菌的致病性強弱有關(guān)。紫外照射是誘導(dǎo)白藜蘆醇大量合成與代謝的主要方法之一，因此研究葡萄在灰霉菌和紫外誘導(dǎo)下白藜蘆醇的合成及代謝，以及灰霉菌產(chǎn)漆酶對白藜蘆醇的催化機制，對于了解葡萄抗毒素白藜蘆醇的抗病機制、灰霉菌漆酶與白藜蘆醇的互作機制、葡萄抗病品種的選育和利用以及灰霉病的防治具有一定的理論價值和應(yīng)用價值。
　　本研究以來源于不同寄主植物的53株灰霉菌和3個葡萄品種（夏黑、巨峰和法葡）為試驗材料，研究了不同寄主來源的灰霉菌產(chǎn)漆酶的

4、能力和酶活力，并對灰葡萄孢菌SP4菌株的生長速率和致病性進行檢測，利用HPLC分析了葡萄葉片和果實在灰葡萄孢菌SP4或紫外誘導(dǎo)下白藜蘆醇的積累情況，并利用qRT-PCR技術(shù)檢測了灰葡萄孢菌SP4或紫外誘導(dǎo)下葡萄抗病基因的表達情況。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)對不同寄主來源的灰霉菌菌株的產(chǎn)漆酶能力及酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，所有菌株均具有產(chǎn)漆酶的能力，其中，以YSD2菌株產(chǎn)漆酶能力最小，SYYK112產(chǎn)漆酶能力最大。對不同菌株漆酶酶活檢測發(fā)

5、現(xiàn)，菌株YM3產(chǎn)漆酶酶活最大，而菌株YSD1酶活最小，同時，不同菌株產(chǎn)漆酶的能力與酶活無明顯相關(guān)性。其中，灰葡萄孢菌SP4菌株在培養(yǎng)20天時漆酶酶活最大，其生長速度為11.8（mm/d），該菌株可引起三種葡萄葉片和果實不同程度發(fā)病。
　　(2)通過灰葡萄孢菌SP4接種和紫外處理葡萄葉片后觀察發(fā)病情況發(fā)現(xiàn)，接菌三個葡萄品種后，巨峰發(fā)病最早，病斑擴展速度也最快，表明巨峰抗病性最差。紫外處理后，巨峰葉片損傷最大，法葡的損傷最小，表明巨峰

6、抗紫外脅迫能力較差，夏黑次之，法葡最好。
　　(3)采用HPLC檢測灰葡萄孢菌SP4誘導(dǎo)和紫外處理后三個葡萄材料葉片或果實中白藜蘆醇(Resveratrol，Res)及其代謝產(chǎn)物含量發(fā)現(xiàn)，SP4可誘導(dǎo)三個葡萄材料葉片Res及其代謝衍生物糖苷Piceid(PD)和二聚體ε-viniferin合成，不同葡萄品種中各產(chǎn)物隨接種時間變化趨勢不同，以48h或96h或168h含量最高。表明灰葡萄孢菌誘導(dǎo)葡萄葉片Res合成后主要代謝為PD和ε-

7、viniferin。同時，灰葡萄孢菌能誘導(dǎo)夏黑和巨峰果皮中Res合成，其合成量低于葉片。采用不同時間紫外誘導(dǎo)葡萄葉片后，Res、PD、PS和ε-viniferin合成量均增加，且與紫外照射時間呈正相關(guān)，其中，Res的合成量均顯著高于PD、PS和ε-viniferin，表明葡萄葉片中Res的累積是代謝合成PD、PS和ε-viniferin的前提條件。紫外誘導(dǎo)后比較不同葡萄品種各產(chǎn)物含量發(fā)現(xiàn)，Res和ε-viniferin的合成量均為:法葡

8、＞夏黑＞巨峰。比較兩種處理發(fā)現(xiàn)，紫外處理后的葉片中Res和PD合成量均顯著高于灰葡萄孢菌接菌，表明紫外照射對白藜蘆醇合成及代謝的誘導(dǎo)作用更強。同時，除法葡外，夏黑和巨峰葉片中PS的含量都顯著增加，表明PS可能是葡萄葉片在紫外誘導(dǎo)下的芪化物響應(yīng)因子。
　　(4)采用qRT-PCR法對灰葡萄孢菌SP4和紫外處理后不同葡萄抗病相關(guān)基因表達情況進行研究，結(jié)果顯示:接菌后，夏黑和巨峰葉片中RS、STS、PAL、 MYBBF2和MYB14F基

9、因表達量變化趨勢基本一致:夏黑與巨峰均不表達，法葡表達先增加后減少，且在24 h或48 h時表達最大。三個葡萄材料中PGIP、PR5和PR10基因的變化趨勢一致（除巨峰葉片中PGIP基因不表達外），都為先增加后減少的表達趨勢，且PR10基因的表達量最大。紫外處理后的葉片中，除巨峰葉片中RS基因不表達和法葡葉片中MYBBF2、MYB14F和PR5基因在30min表達量達最大值外，其它抗病相關(guān)基因均呈連續(xù)增加表達的變化趨勢，在60min達最