核盤菌激發(fā)子SsXYN的克隆、純化及性質(zhì)研究.pdf

1、由核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)引發(fā)的油菜菌核病是油菜上的重要病害,目前對(duì)油菜菌核病的防治主要采取以種植抗菌核病品種、加強(qiáng)栽培管理為基礎(chǔ),化學(xué)防治為輔助的綜合治理措施,近年來能夠促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的生物防治越來越受到廣泛關(guān)注。植物病原菌產(chǎn)生的激發(fā)子是一種能夠引起植物防衛(wèi)反應(yīng)的化合物,它通過與細(xì)胞表面或者亞細(xì)胞表面的受體分子結(jié)合啟動(dòng)植物體內(nèi)級(jí)聯(lián)信號(hào)系統(tǒng)以及活化防衛(wèi)基因的表達(dá)等防御機(jī)制在抗病性中發(fā)揮作用,而不是通過

2、殺菌作用,具有化學(xué)農(nóng)藥所不具備的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn),可作為一種新型微生物蛋白農(nóng)藥來解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)病蟲害問題。
　　本文研究的SxXYN基因是通過油菜核盤菌基因芯片信息中篩選出的可能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生非寄主抗性的木聚糖酶基因。以核盤菌菌株NGA4提取的總RNA為模版,利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得SsXYN基因的全長cDNA片段,將其克隆到pMD19-T載體上,菌落PCR、酶切鑒定和T-克隆測(cè)序結(jié)果表明成功克隆了核盤菌SsXYN基因。從pMD19-T

3、:SsXYN載體上,用BamHI和SalI雙酶切切下目的基因片段,將該基因片段連接到原核表達(dá)載體pET32a中。菌落PCR和酶切鑒定結(jié)果顯示成功構(gòu)建了表達(dá)載體pET32a:SsXYN。利用熱擊法將該重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌BL21,獲得攜帶SsXYN基因的大腸桿菌菌株。
　　將獲得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入至易于表達(dá)的大腸桿菌BL21細(xì)胞中。篩選陽性單菌落并擴(kuò)大培養(yǎng),37℃用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。將誘導(dǎo)后的菌株用超聲波破碎,利用His-tag融合

4、蛋白的親和純化方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示獲得大小約78kDa的蛋白。將純化后的蛋白注射至煙草中發(fā)現(xiàn)其能夠體現(xiàn)與細(xì)菌激發(fā)子harpin類似的過敏反應(yīng)。相關(guān)研究表明活性氧迸發(fā)是植物防衛(wèi)反應(yīng)的早期事件之一,該過程可產(chǎn)生以H2O2為主的活性氧。我們利用DAB染色法觀測(cè)激發(fā)子SsXYN是否能夠誘導(dǎo)活性氧迸發(fā)。結(jié)果顯示,該激發(fā)子SsXYN在15min~3h能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的紅褐色聚合物沉淀,說明其在該時(shí)間段產(chǎn)生大量的H2O2,

5、6h后紅褐色聚合物沉淀大量減少直至沒有,說明其誘導(dǎo)H2O2迸發(fā)的能力在后段時(shí)間內(nèi)隨時(shí)間的增加而減弱,該現(xiàn)象符合相關(guān)研究表明的激發(fā)子誘導(dǎo)活性氧迸發(fā)具有雙時(shí)相特征。
　　由于激發(fā)子能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng),這些防衛(wèi)反應(yīng)的發(fā)生一般與相關(guān)防衛(wèi)基因的表達(dá)有關(guān)。因此本實(shí)驗(yàn)將激發(fā)子SsXYN在0h、30min以及6h不同時(shí)間段注射于本式煙中,檢測(cè)相關(guān)防衛(wèi)基因的表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)激發(fā)子SsXYN誘導(dǎo)HSR203J、NbPR1a、NbPR

6、2b、NbLOX、EDS1、NbWIPK、NbWRKY2、NbMEK2、NbMAPKKKa進(jìn)行上調(diào)表達(dá);NbrbohA、NbrbohB、NbNR、NIA則受SsXYN激發(fā)子誘導(dǎo)進(jìn)行下調(diào)表達(dá);NOA1受激發(fā)子誘導(dǎo)表達(dá)但是改變并不明顯。
　　本研究相關(guān)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行為揭示激發(fā)子誘發(fā)非寄主抗性分子機(jī)理和應(yīng)用激發(fā)子防治油菜菌核病奠定基礎(chǔ),對(duì)于開發(fā)以病原菌激發(fā)子為主要成分的新型生物農(nóng)藥,設(shè)計(jì)高效、低毒的植物病害控制策略也具有重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。