大豆疫霉外泌蛋白類激發(fā)子的鑒定.pdf

1、生活在自然界中，無(wú)論是地上部分或是地下部分，植物經(jīng)常受到各種微生物的侵襲，包括細(xì)菌、真菌和卵菌等。因不具有類似動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，寄主植物常依賴自身每一個(gè)細(xì)胞的先天免疫系統(tǒng)來(lái)抵御病原物的侵染。植物先天免疫系統(tǒng)由兩層主要的免疫反應(yīng)組成。首先，植物中的模式識(shí)別受體(PRRs)能夠感知病原微生物的相關(guān)分子模式(MAMPs or PAMPs)，從而識(shí)別各類微生物，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御反應(yīng)(PAMP-triggeredimmunity-PTI)。植物病原

2、微生物產(chǎn)生的激發(fā)子和病原物相關(guān)分子模式(MAMPs orPAMPs)是一類重要的信號(hào)分子，模仿非親和互作中植物與病原微生物的信號(hào)交流，啟動(dòng)不同的級(jí)聯(lián)信號(hào)途徑，導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)(HR)，誘發(fā)植物產(chǎn)生非寄主廣譜抗性，同時(shí)還能使寄主產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性。其次，病原微生物會(huì)產(chǎn)生一類物質(zhì)效應(yīng)因子(effectors)，它能夠抑制宿主的這種識(shí)別，幫助病原微生物侵染。針對(duì)病原微生物的效應(yīng)因子，植物進(jìn)化出了反擊機(jī)制，植物通過(guò)抗性蛋白（R蛋白）直接或間接識(shí)別某

3、些類別的效應(yīng)因子(無(wú)毒蛋白，avr-R)，在侵染位點(diǎn)啟動(dòng)快速?gòu)?qiáng)烈的防御應(yīng)答，即Effector-triggered immunity-ETI，這種效應(yīng)因子啟動(dòng)的防御構(gòu)成植物的第二層防線。
　　 在卵菌中，目前已經(jīng)鑒定的激發(fā)子與PAMPs主要有谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、結(jié)合纖維素的激發(fā)子凝集素(CBEL)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白、壞死誘導(dǎo)蛋白和β-葡聚糖。我們希望通過(guò)我們的研究能在卵菌中找到更多的PAMPs，為卵菌中PAMPs的作用機(jī)制與卵菌的防治提

4、供基礎(chǔ)。本研究利用合成培養(yǎng)液培養(yǎng)大豆疫霉菌，以促進(jìn)其外泌蛋白的大量分泌，通過(guò)硫酸銨沉淀的方法從該培養(yǎng)液中沉淀并收集這些外泌蛋白，利用密理博(Millipore)超濾管對(duì)獲得的蛋白溶液進(jìn)行超濾，然后通過(guò)快速液相色譜FPLC，在大豆疫霉外泌蛋白中分離純化到一個(gè)55KD(Ps55)的蛋白，該蛋白注射本氏煙草葉片48h之后，能夠誘發(fā)煙草的過(guò)敏性反應(yīng)。同時(shí)，通過(guò)該實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，在大豆疫霉菌中摸索出了一套分離純化與鑒定具有激發(fā)子活性蛋白的方法。

5、>　　 激發(fā)子和PAMPs作為一類重要的信號(hào)分子，能模仿非親和互作中植物與病原微生物的信號(hào)交流，啟動(dòng)不同的級(jí)聯(lián)信號(hào)途徑。在大豆疫霉菌中發(fā)現(xiàn)的Ps55蛋白具有激發(fā)子活性，目前，對(duì)于其功能還缺乏足夠的了解。本研究利用LC-MS/MS技術(shù)對(duì)該蛋白進(jìn)行了測(cè)定，共得到11個(gè)不同的蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖譜，通過(guò)對(duì)這11個(gè)圖譜的分析，獲得四個(gè)不同的蛋白質(zhì)。通過(guò)對(duì)這些肽段進(jìn)行比對(duì)分析，確定這11個(gè)肽段分別屬于四個(gè)不同蛋白質(zhì)，分別命名為Ps55-1、Ps55-2

6、、Ps55-3和Ps55-4。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，Ps55-1、Ps55-2和Ps55-4是纖維素酶相關(guān)的一類蛋白，Ps55-3是天冬氨酸酶類蛋白。本研究并通過(guò)生物信息學(xué)方法方法從大豆疫霉的全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘出大量纖維素酶和天冬氨酸蛋白酶類蛋白候選編碼基因。利用RNA-sequencing等技術(shù)分析了大豆疫霉中纖維素酶和天冬氨酸蛋白酶類蛋白候選編碼基因在生活史及侵染各個(gè)階段的轉(zhuǎn)錄情況，為后續(xù)功能基因研究提供了思路，為大豆疫霉防治及新的藥