中國(guó)西南地區(qū)杜鵑—櫟樹(shù)林中疫霉菌的分離鑒定及快速檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、疫霉菌(Phytophthora de Bary)是一類(lèi)世界性分布的重要植物病原菌，該屬的大多數(shù)種都對(duì)寄主植物具有嚴(yán)重的危害性和破壞性。近年來(lái)，鑒于一些疫霉入侵種（如櫟樹(shù)猝死病菌P.ramorum、康沃爾疫霉P.kernoviae和P.alni）對(duì)生態(tài)和經(jīng)濟(jì)造成的重要影響，疫霉菌也受到人們的日益關(guān)注。世界公認(rèn)的疫霉菌種類(lèi)從20世紀(jì)90年代中期的58個(gè)種，增加到目前的116種，其中最近10年里在全球森林生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的疫霉屬新種就達(dá)20余

2、種。中國(guó)目前報(bào)道的疫霉菌總共有28種，其中多為農(nóng)作物的病原真菌。迄今為止，我國(guó)對(duì)由疫霉菌引起的林木病害的研究報(bào)道很少，缺乏對(duì)森林疫霉病菌種類(lèi)、分布、寄主范圍、危害程度等的調(diào)查，更缺少對(duì)森林疫霉檢測(cè)鑒定方法及防控對(duì)策的研究。
　　 自2005年至2011年，本研究利用誘捕分離技術(shù)對(duì)我國(guó)西南部分地區(qū)杜鵑-櫟樹(shù)林中的疫霉菌進(jìn)行了監(jiān)測(cè)和調(diào)查，從林間溪流和土壤中共誘捕分離得到疫霉純菌株275株，并依據(jù)rDNA-ITS等基因序列分析和形態(tài)學(xué)

3、特征，將全部菌株鑒定為9個(gè)種，分別是P.borealisE Hansen,Sutton&Reeser、P.cryptogea Pethybridge&Lafferty、P.gonapodyides(Petersen) Buisman)、P.gregataT.Jung,M.J.C.Stukely&T.Burgess、P.plurivoraT.Jung&T.I.Burgess、P.lacustris Brasier, Cacciola,Ne

4、chwatal,Jung&Bakonyi和P.taxonPgChlamydo以及2個(gè)新種。其中，隱地疫霉P.cryptogea和節(jié)水霉?fàn)钜呙筆.gonapodyides2個(gè)為國(guó)內(nèi)疫霉原有紀(jì)錄種，P.borealis、P.gregata、P.plurivora、P.lacustris和P.taxonPgChlamydo為5個(gè)國(guó)內(nèi)疫霉新記錄種。
　　 其中，2005-2010年期間在云南迪慶地區(qū)的杜鵑-櫟樹(shù)林中誘捕分離得到了73株8

5、種疫霉，分別為P.taxon PgChlamydo43株、P.lacustris9株、P.plurivora6株、P.gonapodyides4株、P.gregata3株、P.cryptogea1株以及兩個(gè)新種7株;分布廣泛的疫霉P.taxonPgChlamydo，為該地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種。而2006-2011年，從四川甘孜和西藏林芝誘捕分離得到的疫霉菌共為202株5種，分別是P.gonapodyides為94株、P.borealis47株、P

6、.taxonPgChlamydo33、P.plurivora17株和P.lacustris11株;其中P.gonapodyides和P.borealis來(lái)自于四川甘孜2個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)和西藏2個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)，是四川甘孜和西藏林芝地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種。
　　 分離自云南迪慶杜鵑-櫟樹(shù)林溪流和土壤中的兩個(gè)新種均為異宗配合，屬于ITS Clade6。盡管這兩個(gè)疫霉新種在形態(tài)學(xué)上同Clade6中的一些疫霉菌比較相似，但通過(guò)ITS和Cox I基因序列的系統(tǒng)發(fā)育

7、分析，卻與這些疫霉存在著顯著的不同。根據(jù)這兩種疫霉的首次發(fā)現(xiàn)地點(diǎn)，將其定名Phytophthora bitahaiensis Huai，Zhao，Tian&Hansen sp.nov.和Phytophthora nixiensis Huai，Zhao，Tian&Hansen sp.nov.，并對(duì)其分別進(jìn)行了描述。在交配型配對(duì)時(shí)，疫霉P.bitahaiensis可同交配型為A2的其他疫霉菌株配對(duì)形成球形或近球形的藏卵器和圍生的雄器，而P.

8、nixiensis則表現(xiàn)為自身不育。這兩種疫霉的孢子囊多為卵形、寬卵形，均無(wú)乳突，巢式或延伸式內(nèi)層出;在PDA、CA和V8S培養(yǎng)基上，P.bitahaiensis的氣生菌絲較少，菌落多呈花瓣?duì)睿鳳.nixiensis在3種培養(yǎng)基上產(chǎn)生的氣生菌絲都非常豐富;利用離體葉片接種培養(yǎng)法，分別用紫丁香(Syringa oblata Lindl.)、日本晚櫻(Cerasus serrulataG.Don ex London var.lannesi

9、ana(Carr.) Makino)、中林46楊(Populus xeuramericana(Dode)Guiner CL.‘zhonglin-46’)、白玉蘭(Magnolia denudataDesr.)、冬青（Ilex purpurea Hassk）、栓皮櫟(Quercus variabilis Blume)6種植物的葉片，對(duì)P.bitahaiensis和P.nixiensis的代表菌株的致病性進(jìn)行初步測(cè)定，結(jié)果表明兩種疫霉對(duì)這些

10、植物葉片均具有一定的致病性。
　　 誘捕分離自我國(guó)云南迪慶、四川甘孜和西藏林芝地區(qū)杜鵑-櫟樹(shù)林中的P.gonapodyides、P.taxon PgChlamydo及新種P.bitahaiensis等疫霉種內(nèi)的不同菌株間都存在較多的ITS或coxI基因序列核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。這些疫霉的遺傳多樣性明顯與其所分離地區(qū)的地理、植被、氣候等環(huán)境的多樣性有關(guān)。
　　 在疫霉菌快速檢測(cè)技術(shù)研究中，利用疫霉屬特異性引物YPh1 F/Yp

11、h2R和Lyse and GoPCR Reagent，通過(guò)直接PCR法對(duì)26個(gè)疫霉菌株、17個(gè)腐霉菌株和3立枯絲核菌菌株進(jìn)行了檢測(cè)試驗(yàn)，結(jié)果顯示引物YPh1 F/Yph2R特異性較強(qiáng)，可以將疫霉菌同其他真菌區(qū)分來(lái);該法省去了提取DNA的繁瑣步驟，可以實(shí)現(xiàn)疫霉菌的快速準(zhǔn)確檢測(cè)和鑒定。另外，利用節(jié)水霉?fàn)钜呙?P.gonapodyides)和栗黑水疫霉(P.cambivora)菌絲可溶性蛋白作為免疫抗原分別注射家兔制備了兩種多克隆抗血清，并用