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文檔簡介
1、副豬嗜血桿菌(Haemo philuspara suis,HPS)是豬群上呼吸道的條件性致病菌,在特定條件下可以引起以纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征的副豬嗜血桿菌病。HPS中wza基因編碼的莢膜多糖輸出蛋白在病原菌的致病過程中發(fā)揮重要的作用,本課題研究了HPS中莢膜多糖輸出蛋白對其粘附及抗吞噬能力的影響,為闡明副豬嗜血桿菌定殖和擴散的分子機制提供理論基礎(chǔ)。本課題主要取得的研究成果如下所示:
1、HPS莢膜多糖輸出蛋白相關(guān)
2、基因wza缺失株的構(gòu)建
通過PCR的方法擴增wza基因的上下游同源臂片斷,同時在上游同源臂5'端引物的和下游同源臂的3'端引物添加USS序列(ACCGCTTGT),再擴增卡那抗性基因表達盒,將這三個片段用重疊PCR的方法拼接后,連接到自然轉(zhuǎn)化載體pK18mobsacB得到重組質(zhì)粒pK18-wza-UKD。將重組質(zhì)粒自然轉(zhuǎn)化入HPSFX0103中,通過kan抗性篩選得到wza基因缺失突變株FX0103-△wza,并對突變株用PC
3、R、RT-PCR、SouthernBlot及WesternBlot進行了鑒定。
2、HPS野生株FX0103與缺失株FX0103-△wza的生物學(xué)特性的比較
將FX0103與FX0103-△wza培養(yǎng)24h并繪制生長曲線,結(jié)果表明缺失wza之后不影響菌株的生長。透射電子顯微鏡觀察表明缺失株的莢膜比野生株薄。對細菌的總多糖和細胞外多糖進行了提取,發(fā)現(xiàn)缺失株總多糖含量高于野生株,而缺失株的胞外多糖卻比野生株少。血清分型試
4、驗結(jié)果表明3個稀釋度下野生株FX0103仍有較強的沉淀線而缺失株FX0103-△wza的沉淀線已經(jīng)很弱甚至消失。該結(jié)果說明莢膜多糖輸出蛋白可能與其血清分型有關(guān)。
3、HPS莢膜多糖輸出蛋白與粘附相關(guān)
將野生株和wza基因缺失株與長至單層的豬腎上皮細胞(PK-15)互做,發(fā)現(xiàn)缺失株FX0103-△wza的粘附能力比野生株FX0103強,并且在90min時二者的粘附能力達到最大。分析缺失株FX0103-△wza的粘附能力
5、增強的原因可能是破壞細菌的莢膜多糖輸出蛋白之后暴露了一些與宿主細胞作用的結(jié)合位點,從而使更多的菌粘附到了細胞表面。
4、HPS莢膜多糖輸出蛋白與細菌的抗吞噬能力相關(guān)
將HPS野生株FX0103和缺失株FX0103-△wza與長至單層的小鼠單核巨噬細胞(RAW264.7)相互作用,結(jié)果表明野生株FX0103抗小鼠單核巨噬細胞的能力比缺失株FX0103-△wza強。比較野生株與缺失株的胞內(nèi)存活能力,發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長,野
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