綿羊甲狀腺中褪黑素的合成及其生理作用的研究.pdf

1、褪黑素（MEL）和甲狀腺素（TH）是綿羊季節(jié)性繁殖調(diào)控通路中的兩個(gè)重要激素。MEL主要由松果體合成并分泌，在其過程中，5-羥色胺-N-乙?；D(zhuǎn)移酶（AA-NAT）和羥基吲哚-氧-甲基轉(zhuǎn)移酶（HIOMT）是其最關(guān)鍵的兩個(gè)酶。AA-NAT是合成過程中的限速酶，而HIOMT是全部過程中的關(guān)鍵酶。TH則來自于甲狀腺的合成與分泌，并受促甲狀腺素釋放激素（TRH），促甲狀腺素（TSH）的調(diào)控。最近在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠的研究中證實(shí)，甲狀腺存在有合成MEL所

2、必須的AA-NAT和HIOMT兩個(gè)關(guān)鍵酶，并分布有褪黑素受體（MT1）。同時(shí)，在人和小鼠的甲狀腺存在TRH及受體（TRHR），以及促甲狀腺素β亞基（TSH-β）的剪接變體，暗示甲狀腺本身可能存在對(duì)TH分泌自主調(diào)節(jié)的機(jī)制以及甲狀腺合成的MEL可能參與了TH的合成調(diào)節(jié)。為了研究綿羊甲狀腺能否通過MEL自主調(diào)控TH的合成，進(jìn)而影響綿羊季節(jié)性繁殖，開展如下研究：
　　1、利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)MEL合成的關(guān)鍵酶基因AA-NAT和HIOM

3、T，以及MT1和調(diào)控TH合成的相關(guān)基因TRH，TRHR，TSH-β，TSHR是否在綿羊甲狀腺表達(dá)。在mRNA水平確定綿羊甲狀腺能否自主合成且分泌MEL，并參與調(diào)控TH合成。結(jié)果表明：綿羊甲狀腺表達(dá)MEL合成的關(guān)鍵酶基因和MEL受體基因，以及調(diào)控TH合成的基因TRH，TRHR和TSHR，但不表達(dá)TSH-β基因。
　　2、通過雙酶常規(guī)消化并分離得到甲狀腺濾泡細(xì)胞，結(jié)合RT-PCR、細(xì)胞免疫熒光和ELISA技術(shù)，對(duì)培養(yǎng)的綿羊甲狀腺細(xì)胞從

4、形態(tài)，甲狀腺特異性基因mRNA和蛋白的表達(dá)以及甲狀腺素T3/T4的合成與分泌功能等方面進(jìn)行鑒定，確定所培養(yǎng)的原代細(xì)胞功能完整性，建立綿羊甲狀腺原代細(xì)胞培養(yǎng)體系。結(jié)果表明：成功地建立了簡便可行的綿羊甲狀腺細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法。為深入研究綿羊甲狀腺的功能提供了實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
　　3、采用組織免疫熒光，Western blot，ELISA等技術(shù)，驗(yàn)證綿羊甲狀腺組織中MEL合成的關(guān)鍵酶基因AA-NAT、HIOMT以及MT1的表達(dá)，進(jìn)而利用體外培

5、養(yǎng)的細(xì)胞，在細(xì)胞水平驗(yàn)證綿羊甲狀腺能否自主合成并分泌MEL，為進(jìn)一步研究綿羊甲狀腺自身合成并分泌的MEL與TH合成的關(guān)系打下基礎(chǔ)。結(jié)果表明：綿羊甲狀腺具有自主合成并分泌MEL的功能，綿羊甲狀腺內(nèi)部可能存在有通過MEL調(diào)控TH合成的新通路。
　　4、運(yùn)用組織免疫熒光，ELISA，qPCR技術(shù)，檢測(cè)外培養(yǎng)的綿羊甲狀腺原代細(xì)胞中TSH-β蛋白的表達(dá)，并用外源MEL對(duì)體外培養(yǎng)的綿羊甲狀腺原代細(xì)胞進(jìn)行處理，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中T3/T4的水平和

6、甲狀腺細(xì)胞TPO的表達(dá)量。確定綿羊甲狀腺自主合成并分泌的MEL是否調(diào)控TH的合成。結(jié)果表明：綿羊甲狀腺組織不表達(dá)TSH-β蛋白，自主合成并分泌的MEL在體外細(xì)胞水平與TH的合成之間沒有關(guān)聯(lián)，但是在外源MEL的刺激下，TPO的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組差異顯著，表明MEL可能參與到甲狀腺濾泡細(xì)胞的抗氧化過程。
　　綜上所述，我們的研究表明，綿羊甲狀腺能夠自主合成并分泌MEL，但綿羊甲狀腺只部分表達(dá)通過MEL通路調(diào)控TH合成的相關(guān)基因，因此，