過氯酸銨對甲狀腺毒作用影響及其生物標志物的研究.pdf

1、過氯酸銨(Ammonium Perchlorate,AP)是過氯酸鹽類的一種,具有強氧化性,其作為固體推進劑已廣泛應用于航天及國防工業(yè)中,同時也用于煙火制造等民用方面,因而存在著AP職業(yè)性接觸及危害。有研究報道,AP對動物甲狀腺具有明顯的毒作用,干擾甲狀腺功能的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。研究已表明:AP是甲狀腺濾泡上皮細胞上鈉碘轉(zhuǎn)運體(NIS)的碘離子的強效抑制劑。目前,已知AP通過競爭性抑制NIS,抑制甲狀腺攝取碘,從而擾亂動物的下丘腦-垂體-甲狀腺軸

2、的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。但利用人正常甲狀腺濾泡上皮細胞(Nthy-ori3-1),在體外探討AP的氧化損傷機制及對細胞因子合成影響的相關(guān)報道較少。AP是如何影響甲狀腺濾泡上皮細胞基底膜上NIS表達,AP如何調(diào)控碘離子氧化合成有機碘的甲狀腺過氧化物酶(TPO)的活性,以及不同劑量AP染毒對合成甲狀腺激素的甲狀腺球蛋白(Tg)表達水平調(diào)控的機制,目前仍不清楚。
　　環(huán)境暴露水平AP是否對人體的甲狀腺功能產(chǎn)生健康影響,在國際范圍仍認識不一,國外學者認

3、為人體存在健全的甲狀腺代償性保護機制,血清甲狀腺功能指標不是指示暴露情況的特異性生物標志物,目前可得到的證據(jù)還不能證實甲狀腺激素水平的變化和過氯酸鹽環(huán)境暴露之間的因果關(guān)系。已知AP進入體內(nèi)不經(jīng)代謝從尿中排出,我們通過染毒動物模型也發(fā)現(xiàn),大鼠尿液中AP隨著暴露劑量的增加而呈劑量反應性增加,故通過測定尿中AP水平能很好地評價其暴露情況。以前的研究選取血清甲狀腺功能參數(shù)作為評價暴露的指標,僅作為效應標志物是非特異性的,無法精確反映暴露劑量與其

4、變化的趨勢。如何選擇敏感、特異的生物標志物評價作業(yè)工人的暴露水平是當務之急。因此,為深入研究AP對甲狀腺的毒作用機制,探討選擇合適的內(nèi)負荷指標,本課題分別從細胞體外實驗、染毒動物模型建立及作業(yè)人群職業(yè)衛(wèi)生調(diào)查三個方面,來研究AP對甲狀腺細胞氧化損傷機制及特異性蛋白表達、血清甲狀腺功能參數(shù)的影響,并評價尿中AP作為職業(yè)暴露人群生物標志物的有效性,以期能選擇合適的內(nèi)負荷指標,對職業(yè)暴露的作業(yè)工人進行早期的健康監(jiān)護,為保護工人健康和預防控制其

5、可能產(chǎn)生的職業(yè)危害提供科學方法和參考依據(jù)。
　　第一部分：過氯酸銨對甲狀腺細胞毒作用機制的研究
　　目的:研究AP對人甲狀腺細胞(Nthy-ori3-1)氧化應激及誘導凋亡的影響,同時探討AP對甲狀腺細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量及對特異性蛋白NIS、Tg、TPO及cAMP蛋白水平表達的的影響。
　　方法:體外培養(yǎng)Nthy-ori3-1細胞,接觸不同濃度AP(0、5、10、20、40mmol/L)及KI(

6、5、25mmol/L)聯(lián)合染毒后置37℃,5％CO2培養(yǎng)24h,CCK8法檢測Nthy-ori3-1細胞的增殖活力,流式細胞儀檢測細胞凋亡率及細胞內(nèi)活性氧(ROS),同時測定氧化損傷指標丙二醛(MDA)及過氧化氫酶(CAT)活力;收集細胞上清液,采用ELISA試劑盒,上酶標儀測定吸光度值,根據(jù)標準曲線進行定量;收集細胞裂解后提取蛋白,采用Western blotting測定甲狀腺細胞特異蛋白NIS、Tg、TPO及cAMP蛋白水平的變化。

7、
　　結(jié)果:AP抑制Nthy-ori3-1細胞增殖具有明顯的劑量依賴性。與對照組相比,各組細胞內(nèi)ROS生成量隨著染毒劑量的增加出現(xiàn)降低趨勢,除5mmol/LAP劑量組外,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);較高劑量AP染毒(40mmol/L)甲狀腺細胞,MDA生成量比對照組有明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001);各染毒劑量組細胞內(nèi)CAT活力比對照組有升高的趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);高AP劑量組IL-1β水平

8、比低劑量組明顯下降(P<0.05);AP中、高劑量組及AP高碘組(40mmol/LAP+25mmol/LKI)的IL-6水平比對照組明顯降低(P<0.01);AP高劑量組、AP低碘組(40mmol/LAP+5mmol/LKI)及AP高碘組(40mmol/LAP+25mmol/LKI)的TNF-α水平比對照組明顯下降(P<0.01);與對照組(0.758)相比,低、中、高AP染毒劑量組Tg水平分別為0.563、0.484、0.211,呈現(xiàn)

9、明顯降低趨勢(P<0.05);低、中、高AP染毒劑量組TPO表達水平分別為0.521、0.489、0.246,隨著染毒劑量增加而明顯降低(P<0.05);而NIS、cAMP表達水平隨染毒劑量增加無明顯變化(P>0.05)。
　　結(jié)論:AP可致Nthy-ori3-1細胞出現(xiàn)氧化應激,誘導細胞凋亡,細胞內(nèi)ROS量隨著染毒劑量的增加而降低,且二者之間存在明顯的劑量反應關(guān)系。當染毒AP濃度為40mmol/L時,對甲狀腺細胞明顯產(chǎn)生氧化損傷

10、作用,碘在一定程度上可緩解AP對甲狀腺細胞的氧化應激反應;AP染毒Nthy-ori3-1細胞可隨著染毒劑量的增加,細胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)生成量降低的趨勢越明顯,這可能是細胞自身負反饋調(diào)節(jié)機制在發(fā)揮作用;AP可通過抑制特異性轉(zhuǎn)錄因子表達水平從而引起Tg、TPO蛋白表達水平下調(diào),從細胞層面再次驗證AP可抑制甲狀腺激素合成的關(guān)鍵蛋白的表達水平,從而直接干擾甲狀腺激素的合成過程。
　　第二部分：過氯酸銨對作業(yè)人群甲狀

11、腺功能的影響
　　目的:了解AP粉塵職業(yè)性危害對作業(yè)工人健康的影響,為其預防措施提供科學依據(jù)。
　　方法:選擇該廠接觸AP粉塵的51名作業(yè)工人為接觸組,不接觸AP粉塵的41人為對照組。調(diào)查工廠的一般情況,監(jiān)測作業(yè)場所的AP粉塵濃度,對兩組人群進行職業(yè)體檢,檢測血常規(guī)、肝腎功能、甲狀腺激素、尿碘含量,進行肺通氣功能檢查,同時對職業(yè)接觸史等基本情況進行健康調(diào)查問卷。
　　結(jié)果:粉塵是AP作業(yè)場所最主要的職業(yè)性有害因素,本次

12、調(diào)查各生產(chǎn)車間粉塵濃度均較低,以烘干過篩、稱量車間最高,均為1.175mg/m3;復分解車間最低,為0.425mg/m3。體檢結(jié)果顯示,兩組人群經(jīng)比較,接觸組血壓舒張壓(69.67mmHg)明顯低于對照組(79.02mmHg)(P<0.05);接觸組工人氣短癥狀的檢出率(9.80%)明顯高于對照組(0%)(P<0.05);接觸組工人尿素氮(BUN)(5.27U/L)明顯高于對照組(4.30U/L),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),但二

13、者均在正常參考值范圍內(nèi)而無臨床意義;接觸組的TT4(65.61ng/ml)水平明顯低于對照組(81.88ng/ml),TSH(3.75mIU/L)明顯高于對照組(2.68mIU/L),差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);接觸組血清FT4(11.67fmol/ml)也低于對照組(13.14fmol/ml),但其差異尚不顯著。
　　結(jié)論:接觸組工人的血清FT4、TT4水平比對照組降低,而TSH則比對照組升高,可能是接觸AP所致,提示長

14、期接觸AP粉塵可能會對作業(yè)工人甲狀腺功能造成不良影響。
　　第三部分：過氯酸銨接觸的生物標志物研究
　　目的:建立敏感、特異、快速測定生物材料中AP含量的方法,為AP職業(yè)人群進行早期生物監(jiān)測提供科學依據(jù)。
　　方法:利用嚴格控制染毒劑量的大鼠尿液標本進行預實驗,對測定方法的各測量參數(shù)進行初步探索;采集接觸組與對照組工人的生物材料(血、尿樣),采用簡單稀釋的樣品前處理方法,同時利用同位素內(nèi)標技術(shù)消除基質(zhì)效應,運用已初步建

15、立的超高效液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS),對兩組人群生物材料中AP進行定量分析及評價。
　　結(jié)果:AP經(jīng)口飲水染毒在0~520mg/kg/day劑量范圍內(nèi),大鼠尿中AP含量水平與染毒劑量存在明顯相關(guān)關(guān)系(R2=0.8342),回歸方程為Y=5.5222X+291.17。方法的準確度及精密度分別為91.7~99.61%、3.37~7.08%;接觸組工人血、尿中AP含量的平均值分別為2.463、12.82μg/L,中位

16、數(shù)分別為2.59、4.89μg/L;對照組工人血、尿中AP含量平均值分別為1.00、9.10μg/L,中位數(shù)分別為0.83、3.56μg/L。接觸組工人血、尿中AP含量與對照組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:尿中AP水平可作為其暴露的有效生物標志物。相比于尿液,血中AP指示環(huán)境暴露更為敏感、特異,但樣本不易取得,在人群生物監(jiān)測中應用有其難度。采集特定人群尿樣對其過氯酸鹽含量進行測定不失為評價環(huán)境暴露的優(yōu)選方法