肝細胞癌分子標志物的篩選及其生物學功能研究.pdf

1、第一章用蛋白質(zhì)組學方法篩選肝癌特異性分子標志物
　　 目的:采用二維凝膠電泳與基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（2-DE/MALDI-TOF MS）方法篩選并鑒定肝細胞癌組織(HCC)和癌旁無瘤組織的差異表達蛋白質(zhì)，并分析其與臨床病理學特征的相關(guān)性。
　　 方法:收集27對肝細胞癌組織和癌旁無瘤新鮮組織，用2-DE技術(shù)分離各組蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍染色后用PDQuest圖像分析軟件識別各差異蛋白質(zhì)點，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析/

2、電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)鑒定各差異蛋白質(zhì)。分別抽提各組織的mRNA和蛋白質(zhì)，用RT-PCR和Western blot法，對差異表達蛋白質(zhì)PRDX3進行轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平的驗證。收集119例肝細胞癌組織和36例癌旁無瘤組織病理標本，用免疫組織化學法檢測差異蛋白質(zhì)過氧化物酶3(PRDX3)在各肝癌組織中的表達情況，進一步探討PRDX3的表達與臨床病理學特征之間的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:(1)采用2-DE方法篩選到4

3、3個差異表達蛋白質(zhì)點，并用MALDI-TOF MS鑒定了其中22個差異蛋白質(zhì)，其中15個在HCC中表達上調(diào)，它們分別是:亞胺甲基轉(zhuǎn)移酶環(huán)脫胺酶，線粒體醛脫氫酶，視網(wǎng)膜脫氫酶1，超氧化物歧化酶[Cu-Zn]，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶A1，鈣調(diào)磷酸酶B1，氨基?；?1，T復合體蛋白11樣蛋白1，抑素，磺基轉(zhuǎn)移酶1A2，3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶，硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶，人腔鈣蛋白，果糖激酶。7個在HCC中表達下調(diào)，它們分別是:CAP-G

4、ly結(jié)構(gòu)域連接蛋白4，載脂蛋白A-(Ⅰ)，大同源物3，脯氨酰肽基異構(gòu)酶A，二磷酸核昔激酶A，半胱氨酸蛋白酶抑制因子B。根據(jù)其功能，將上述蛋白質(zhì)進行分類，其中與物質(zhì)代謝相關(guān)的有9個(9/22，40.9％)，與抗凋亡相關(guān)的有4個(4/22，18.2％)，與信號轉(zhuǎn)導相關(guān)的有7個(7/22，31.8％)，與氧化還原調(diào)節(jié)相關(guān)的有5個(5/22，22.7％)，與細胞骨架相關(guān)的有3個(3/22，13.6％)，與解毒作用相關(guān)的有2個(2/22，9.1％

5、)，分子伴侶有3個(3/22，13.6％)，與蛋白質(zhì)水解相關(guān)的有1個(1/22，4.5％)，涉及DNA合成和細胞分化的有2個(2/22，9.1％)。其中PRDX3蛋白(m/z1462.9，Mascot得分57分，序列覆蓋率21％，mass28.02 kDa，pI7.67)因在肝癌組織中的表達水平顯著高于癌旁無瘤組織，并與腫瘤中氧化應(yīng)激反應(yīng)有密切關(guān)系，是我們比較感興趣的一個差異表達蛋白。
　　 (2) RT-pCR分析結(jié)果顯示，P

6、RDX3 mRNA在肝癌組織中的表達水平（0.79±0.14）顯著高于癌旁無瘤組織（0.15-0.05）; Westernblot分析顯示，PRDX3蛋白在肝癌組織中的表達水平（0.82±0.13）顯著高于癌旁無瘤組織（0.52±0.09），差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　 (3)免疫組化結(jié)果顯示，PRDX3蛋白在肝癌組織中的表達(94.9％)高于癌旁無瘤組織及正常組織，并且其表達水平與肝細胞癌的低分化分級有顯著相關(guān)性

7、(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:成功的篩選出了22個差異表達蛋白質(zhì)，其中PRDX3在肝癌組織中高表達，且PRDX3的表達與組織分化程度相關(guān)，推測其可能參與肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程。
　　 第二章PRDX3 siRNA對HepG2細胞生物學功能的影響
　　 目的:檢測PRDX3蛋白在各肝癌細胞株中的表達情況，及其對HepG2細胞的增殖、凋亡、遷移等生物學功能的影響。
　　 方法:用RT-PCR、Wester

8、n blot法檢測PRDX3 mRNA和蛋白質(zhì)在肝癌細胞系HepG2、Hep3B、QGY-7703、HuH7及正常肝細胞系QSG-7701中的表達。構(gòu)建含PRDX3的小干擾RNA的質(zhì)粒pRNAT-PRDX3 siRNA，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肝癌細胞HepG2，另設(shè)立陰性對照組和空白對照組，通過MTT、流式細胞術(shù)、平板克隆形成實驗、劃痕實驗等檢測PRDX3表達下調(diào)后對HepG2細胞的增殖、凋亡、遷移等生物學功能的影響。
　　 結(jié)果:(1

9、) PRDX3蛋白在所檢測的四種肝癌細胞系中均有不同程度的表達，相對表達強度分別為0.32±0.03、0.33±0.03、0.29±0.02、0.31±0.04;在正常肝細胞QSG-7701中表達較弱。
　　 (2)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PRDX3siRNA后，HepG2細胞中的PRDX3mRNA和蛋白表達受到較為明顯的抑制。MTT實驗檢測發(fā)現(xiàn)，PRDX3基因沉默組(HepG2/siPRDX3)細胞生長速度比陰性對照組(HepG2/siNC)

10、細胞的生長速度減慢，克隆形成實驗表明PRDX3基因沉默組（HepG2/siPRDX3）細胞的集落形成率明顯下降，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示沉默組的凋亡細胞比例顯著高于陰性對照組，細胞遷移實驗表明PRDX3表達減少后，HepG2細胞的遷移能力下降。這些表明PRDX3基因可能通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的表達水平來促進細胞增殖、保護腫瘤細胞抵抗凋亡，從而引起肝細胞的惡性轉(zhuǎn)化。
　　 結(jié)論:PRDX3的表達能夠促進肝癌細胞的增殖，抑制肝癌細胞的凋