種子春化型芥菜BjSVP與綠體春化型甘藍BoFLC異源蛋白互作的研究.pdf

1、甘藍(Brassica oleracea L.)和芥菜(Brassica juncea Coss.)都是我國普遍種植的蔬菜作物。均屬于十字花科蕓薹屬，它們必須通過低溫春化處理才能生長開花。其中，芥菜屬于種子春化型即種子處在萌動狀態(tài)，就能感受低溫的誘導;而甘藍為綠體春化型，即植株幼苗需長到一定大小，積累一定營養(yǎng)物質(zhì)后，才能感受低溫的誘導。種子春化型植物與綠體春化型植物的區(qū)別是感受低溫的部位不同:種子萌發(fā)時感受低溫的部位是胚，而營養(yǎng)體時期的

2、感受部位為莖尖。開花是植物體從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長的過渡階段，標志著植物即將完成整個生命過程。開花時間的前移或推后，會在生產(chǎn)上、育種上和F1代制種上給植物帶來許多不利的因素。因此，研究甘藍、芥菜抽薹開花的調(diào)控機制，在生產(chǎn)上對擴大面積栽培和選育優(yōu)質(zhì)品種上都具有十分重要的意義。
　　影響甘藍、芥菜抽薹開花的調(diào)控途徑與擬南芥相似，它們均受春化途徑、光周期途徑、赤霉素途徑、自主途徑和溫敏途徑等多條路徑的調(diào)控。這些途徑涉及到的多種開花調(diào)控信

3、號，最終匯入到開花途徑整合子FLOWERING LOCUST(FT)和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1(SOC1)。整個花期調(diào)控網(wǎng)絡中處于核心位置的兩個典型MADS蛋白FLOWERING LOCUSC(FLC)和SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP)，通過相互作用形成二聚體抑制開花信號整合子的表達，使抽薹開花延遲。目前，在種子春化型植物擬南芥、芥菜，綠體春化作物型甘藍中均

4、證實了FLC與SVP蛋白之間能發(fā)生相互作用形成聚合復合體。但是，前人的研究報道只表明在同源植物中FLC與SVP存在互作，對來源于不同作物的FLC與SVP之間的是否存在蛋白互作還未見報道。
　　為闡明種子春化作物芥菜BjSVP與綠體春化作物甘藍BoFLC異源蛋白互作機制。本試驗以芥菜'QJ'和甘藍'ZQ'為實驗材料，克隆了BoFLC、BjSVP及BjSVP截短體（BjSVP1～BjSVP11），利用酵母雙雜交技術(shù)分別構(gòu)建了全長BoF

5、LC、BjSVP及BjSVP截短體的酵母重組載體，對綠體春化作物甘藍BoFLC與種子春化作物芥菜BjSVP之間的相互作用進行分析、篩選并鑒定該蛋白互作的主要結(jié)構(gòu)域。
　　1、全長BoFLC、BjSVP及BjSVP截短體的克隆與分析
　　根據(jù)FLC與SVP基因的結(jié)構(gòu)特點和識別特性，設計特異性引物，以甘藍'ZQ'和芥菜'QJ'材料的莖尖反轉(zhuǎn)錄eDNA為模板，進行PCR擴增克隆出BoFLC與BjSVP的全長基因，基因片段大小分別為

6、625bp、757bp，分別編碼197、241個氨基酸殘基。菌液PCR、酶切及測序結(jié)果表明，全長基因的序列正確。以pEAST-BluntSimple-BjSVP質(zhì)粒為模板，用特異性引物亞克隆BjSVP截短體(BjSVP1～11)，其分別編碼95、173、78、179、146、111、86、80、64、52和33個氨基酸。菌液PCR、酶切及測序結(jié)果表明，截短體的序列正確。
　　2、全長BoFLC與BjSVP相互作用的鑒定
　　

7、利用酵母雙雜交系統(tǒng)，將構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-BoFLC、獵物質(zhì)粒pGADT7-BjSVP的酵母表達載體分別轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y2HGold、Y187中。Y2HGold的活性比Y187的強，得到酵母轉(zhuǎn)化子Y2HGold(pGBKT7-BoFLC)、Y187(pGADT7-BjSVP)，在缺陷型選擇性培養(yǎng)基進行鑒定，發(fā)現(xiàn)菌落生長正常，表明無自激活和毒性現(xiàn)象。融合后的二倍體酵母Y187(pGADT7-BjSVP)×Y2HGold(pGBKT

8、7-BoFLC)能在選擇型培養(yǎng)基 SD/-Leu/-Trp/AbA(DDO/A)、 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp(QDO)、 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA(QDO/X/A)上正常生長。且在QDO/X/A培養(yǎng)基上長出的菌落呈藍色。結(jié)果表明從芥菜中克隆到的全長SVP能與從甘藍中克隆得到的FLC蛋白相互聚合形成二聚復合體，激活了酵母中的4個報告基因A UR1-C、HIS3、ADE2、ME

9、L1的表達。
　　3、BoFLC作用于BjSVP結(jié)構(gòu)域的篩選及鑒定
　　將分別編碼蛋白結(jié)構(gòu)域MI、MIK、K、IKC、KC、IK、IK1L1K2L2、IK1L1K2、IK1L1、IK1、I的11個BjSVP截短體（BjSVP1～BjSVP11）與酵母表達載體PGADT7結(jié)合，構(gòu)建酵母表達獵物重組質(zhì)粒pGADT7-Bj SVP1～pGADT7-Bj SVP11并轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187。得到酵母轉(zhuǎn)化子Y187(pGADT7-Bj

10、SVP1～11)，經(jīng)過缺陷型選擇性培養(yǎng)基的鑒定，發(fā)現(xiàn)無自激活和毒性現(xiàn)象產(chǎn)生。融合后含二倍體的重組酵母菌只有Y187(pGADT7-Bj SVP2～6)×Y2HGold(pGBKT7-BoFLC)雜交組合能在選擇型培養(yǎng)基QDO/X/A上長出正常藍色菌落。結(jié)果表明，截短體BjSVP2～BjSVP6能與BoFLC發(fā)生相互作用，而BjSVP1、BjSVP7～BjSVP11則不能與BoFLC互作。由此可知BjSVP完整的K域(Bj SVP3)可獨