豬戊型肝炎病毒抗原性及諾如病毒與宿主蛋白互作的研究.pdf

1、本課題研究涉及戊型肝炎病毒和諾如病毒，兩種病毒在病毒結(jié)構(gòu)及其傳染危害上有一定相似性。二者均為單股正鏈RNA二十面體病毒，都感染人及其它動(dòng)物種屬，病毒傳播重要途徑之一是糞口傳播，前期都因無高效體外培養(yǎng)系統(tǒng)阻礙對(duì)病毒感染復(fù)制機(jī)理的研究。兩種病毒在研究思路及方法上有很多可相互借鑒之處。
　　第一部分 豬戊型肝炎病毒
　　戊型肝炎（Hepatitis E）由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)感染引起的一種傳染

2、性自限性肝炎。全球每年約有2000萬人被HEV感染，導(dǎo)致約5.66萬人死亡。哺乳動(dòng)物HEV包括HEV-1到HEV-7七個(gè)亞型，其中HEV-3和HEV-4具有人畜共感染性，其可感染人、豬和兔等物種。豬是人畜共患HEV的主要儲(chǔ)存庫，在全球豬群內(nèi)HEV抗體均呈現(xiàn)高陽性率(46％-100％)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)豬HEV-3和HEV-4可以感染靈長類動(dòng)物恒河猴，且在日本、法國、德國、西班牙和澳大利亞等人戊型肝炎散發(fā)案例表明:人HEV的感染與直接食用未煮熟的

3、豬HEV污染的豬肉及臟器食品有關(guān)。基于豬HEV的人畜共患傳播風(fēng)險(xiǎn)，本課題分離鑒定了山東地區(qū)豬HEV的流行毒株并對(duì)該地區(qū)豬群中HEV流行情況進(jìn)行了調(diào)查。
　　HEV衣殼蛋白包含病毒顆粒主要抗原表位，能夠誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。對(duì)衣殼蛋白抗原結(jié)構(gòu)精細(xì)化鑒定有利于促進(jìn)血清診斷和疫苗的研發(fā)。研究證實(shí)，禽HEV衣殼蛋白中抗原區(qū)Ⅰ(aa389-410)中存在一個(gè)禽、人和豬HEV共有表位。但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)豬和人的抗HEV陽性血清能與不含抗原區(qū)Ⅰ的禽HE

4、V重組蛋白交叉反應(yīng)，這表明還存在其它禽、人和豬HEV共有抗原表位。本課題精確鑒定了不同物種HEV共有抗原表位，加深了對(duì)HEV衣殼蛋白的抗原結(jié)構(gòu)了解，并且對(duì)于開發(fā)HEV的血清診斷和疫苗設(shè)計(jì)有一定借鑒意義。
　　1.山東地區(qū)豬戊型肝炎病毒基因組序列特征分析及感染率調(diào)查
　　在本研究中，利用HEV ORF2部分基因建立的RT-nPCR方法檢測(cè)了來自中國山東省屠宰場(chǎng)的106份膽汁樣品中HEV RNA;利用間接ELISA方法對(duì)山東地區(qū)

5、24個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)980豬血清樣品中的抗豬HEVIgM和IgG特異性抗體陽性率進(jìn)行了調(diào)查。研究發(fā)現(xiàn)106份膽汁樣品中32份是HEV RNA陽性(30.2％)，從樣品中檢測(cè)到20個(gè)不同同源性(86.8-100％)的ORF2片段序列。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)這些病毒序列屬于基因4型HEV的4a和4d亞型。同時(shí)測(cè)定了一株4d亞型豬HEV毒株。對(duì)山東24個(gè)地區(qū)豬群中抗HEV抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)IgG和IgM血清陽性率分別為100％(24/24)和41.7％(1

6、0/24)，對(duì)豬個(gè)體陽性率分析，發(fā)現(xiàn)IgG和IgM的陽性率分別為69.4％(651/980)和1.6％(16/980)。結(jié)果表明，在山東地區(qū)豬養(yǎng)殖場(chǎng)和屠宰場(chǎng)中，基因4型HEV普遍流行，這對(duì)公共衛(wèi)生安全是巨大挑戰(zhàn)，應(yīng)加強(qiáng)防護(hù)及安全保護(hù)措施。
　　2.兩個(gè)戊型肝炎病毒共有抗原表位的鑒定
　　本研究發(fā)現(xiàn)，由禽HEV衣殼蛋白制備的單克隆抗體(MAb)3E8和1B5能與豬HEV衣殼蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，暗示這兩株抗體可能識(shí)別禽和豬HEV共

7、有抗原表位。利用生物淘選、多肽合成、截短或突變的重組蛋白表達(dá)，綜合利用ELISA和Western blot方法來鑒定和驗(yàn)證兩株單克隆抗體所識(shí)別的抗原表位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3E8表位核心區(qū)為I/VPHD，其中P和H是關(guān)鍵氨基酸;1B5表位為VKLYM/TS。兩抗原表位在不同種屬HEV衣殼蛋白序列中高度保守，推測(cè)它們可能也是野豬、兔、大鼠、雪貂、貓鼬、鹿和駱駝HEV的共有抗原表位。蛋白三維模型分析發(fā)現(xiàn)兩個(gè)表位至少部分暴露于HEV病毒顆粒表面，推測(cè)

8、其可能有中和活性，但中和保護(hù)性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3E8和1B5表位對(duì)雞沒有保護(hù)作用。本研究鑒定了人、豬和禽HEVs衣殼蛋白上兩個(gè)共有抗原表位，對(duì)了解HEV衣殼蛋白抗原結(jié)構(gòu)和開發(fā)診斷試劑有推動(dòng)作用。
　　第二部分 諾如病毒與宿主蛋白互作的研究
　　諾如病毒(HuNoV)屬單股正鏈RNA病毒，是引起人急性胃腸炎的主要病原。全球每年約20萬人因HuNoV感染死亡，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。由于缺乏高效HuNoV體外培養(yǎng)系統(tǒng)，嚴(yán)重延緩了對(duì)病毒感染復(fù)制

9、機(jī)理的研究。鼠諾如病毒(MNV)與HuNoV遺傳關(guān)系密切，是研究諾如病毒感染復(fù)制機(jī)理的理想模型。VPg蛋白在病毒基因組復(fù)制、病毒蛋白翻譯及抑制宿主細(xì)胞抗病毒反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用，是構(gòu)成具有感染性的RNA所必須的組分。VP2蛋白是由ORF3編碼的次衣殼蛋白，參與病毒組裝并能增強(qiáng)20面體病毒顆粒的穩(wěn)定性，是形成具有感染性病毒的必要組分。但目前對(duì)宿主細(xì)胞中參與及輔助VPg及VP2蛋白功能及代謝過程的宿主蛋白尚不清楚，為此我們利用MNV模型，

10、開展鑒定與諾如病毒VPg和VP2蛋白相互作用的宿主細(xì)胞蛋白及其功能的研究。
　　1.宿主細(xì)胞與諾如病毒VPg相互作用蛋白的鑒定
　　本研究中，我們利用基于同位素標(biāo)記(SILAC)的免疫共沉淀及質(zhì)譜檢測(cè)方法來鑒定宿主細(xì)胞中與MNV和HuNoV VPg相互作用蛋白。MNV VPg IP質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到91個(gè)陽性宿主蛋白，其中37個(gè)蛋白會(huì)因F123A突變喪失與VPg互作能力。同樣，HuNoV質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示95個(gè)宿主蛋白可能與WT VP

11、g互作，同時(shí)F137A的突變導(dǎo)致12個(gè)蛋白不再結(jié)合。對(duì)MNV和HuNoV互作蛋白數(shù)據(jù)的共同分析發(fā)現(xiàn)，包括eIF3和eIF4F轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物（eIF3A、eIF4G1和eIF4E等）及G3BP1和YBX1在內(nèi)的48個(gè)宿主蛋白與二者均有較強(qiáng)結(jié)合能力。其中，在鑒定的靶蛋白中包括已被證實(shí)與VPg相互作用的eIF4G1和eIF4E蛋白，證明SILAC GFP親和純化實(shí)驗(yàn)的可信性。基于前期研究背景，我們優(yōu)先驗(yàn)證YBX1與G3BP1與VPg的相互作用

12、，進(jìn)而探究其在諾如病毒感染宿主細(xì)胞中參與的代謝過程及機(jī)理。
　　2.鼠諾如病毒VP2蛋白與宿主細(xì)胞互作蛋白的鑒定
　　為了探究MNV感染宿主細(xì)胞過程中與VP2蛋白相互作用的宿主細(xì)胞蛋白及其作用機(jī)理，本研究利用帶有FLAG標(biāo)簽的重組MNV以及基于SILAC標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，探究了MNV感染中參與VP2功能代謝的宿主蛋白。通過分析比較野生型病毒感染的陰性對(duì)照組與VP2-FLAG MNV感染的實(shí)驗(yàn)組IP樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)，共發(fā)現(xiàn)