甘藍(lán)型油菜種子萌發(fā)時(shí)期油體蛋白雙向電泳分析.pdf

1、油體是植物儲(chǔ)存油脂的一種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其中心部分是由三酰甘油組成的半透明基質(zhì)，外層包裹磷脂單分子層，其中鑲嵌多種油體結(jié)合蛋白。油體結(jié)合蛋白在油體的發(fā)生和富集、穩(wěn)定和降解、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白和脂類轉(zhuǎn)運(yùn)等過程中起到非常重要的作用。前人對(duì)于植物油體及油體蛋白的研究局限于靜態(tài)研究方面，對(duì)于油體降解的動(dòng)態(tài)過程研究較少。因此，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)萌發(fā)時(shí)期油體進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析有助于進(jìn)一步解析油體降解過程中油體蛋白的組分、修飾狀態(tài)等變化規(guī)律，這對(duì)于深入

2、了解油體降解的分子機(jī)理以及探究油體相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能具有重要意義。
　　本研究以甘藍(lán)型油菜種子鼎油雜4號(hào)為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)萌發(fā)時(shí)期油菜種子油體形態(tài)變化、生理指標(biāo)等進(jìn)行了研究，同時(shí)采用雙向電泳的方法對(duì)萌發(fā)過程中油體蛋白的變化規(guī)律及表達(dá)情況進(jìn)行分析探究，為本實(shí)驗(yàn)室后續(xù)開展的油菜種子萌發(fā)時(shí)期具有穩(wěn)定差異表達(dá)規(guī)律的油體蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定以及油體降解的分子機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)建立了油菜種子油體熒光顯微觀察方法，探

3、索了種子萌發(fā)過程中油體形態(tài)變化規(guī)律;確定了油體蛋白雙向電泳研究的取樣時(shí)間。采用石蠟切片方法結(jié)合尼羅紅染色對(duì)甘藍(lán)型油菜種子萌發(fā)過程中油體形態(tài)進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示:油體的降解主要發(fā)生在24小時(shí)之后，其中24-36小時(shí)之間油體降解幅度較大。綜合油菜種子萌發(fā)時(shí)期生理研究及油體形態(tài)變化規(guī)律，將油體蛋白雙向電泳研究的取樣時(shí)間確定為0h、24h、36h、48h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)。
　　(2)優(yōu)化了油體提取方法，獲得較高純度的油體;探索了環(huán)境因素對(duì)油體穩(wěn)定

4、性的影響，結(jié)果顯示pH和離子濃度對(duì)油體的穩(wěn)定性影響較大，溫度對(duì)油體的穩(wěn)定性影響較小。在原有提取油體的基礎(chǔ)上增加9M尿素洗脫和正己烷萃取等步驟，獲得了較高純度的油體，鏡檢結(jié)果顯示油體平均直徑為2.19μm。綜合溫度、pH、離子濃度等環(huán)境因素研究了不同環(huán)境條件對(duì)油體穩(wěn)定性的影響，結(jié)果顯示:在pH4-6之間油體穩(wěn)定性明顯下降，油體直徑明顯增大，pH值為5時(shí)油體直徑達(dá)到最大值5.5μm為對(duì)照的228％;隨著離子濃度的增加油體穩(wěn)定性下降，油體直徑

5、持續(xù)增加，當(dāng)NaCL濃度增加至250mM時(shí)油體直徑達(dá)到5.62μm為對(duì)照的257％;溫度對(duì)油體穩(wěn)定性幾乎無影響，不同溫度下油體平均直徑為2.33μm。
　　(3)優(yōu)化了甘藍(lán)型油菜種子油體蛋白雙向電泳體系(two-dimensionalgelelectrophoresis，2D-PAGE)。通過純化油體并在實(shí)驗(yàn)室已有提取蛋白方法的基礎(chǔ)上提取萌發(fā)時(shí)期油菜種子油體蛋白;選取60mMTris裂解液(7MUrea，2M硫脲，4％CHAPS，

6、2％兩性電解質(zhì)pH3-10，2％DTT，60mMTris)裂解蛋白干粉;確定油體蛋白雙向電泳凝膠的最佳染色方法為硝酸銀染色法。
　　(4)利用優(yōu)化的管狀凝膠雙向電泳體系，對(duì)萌發(fā)時(shí)期油菜種子油體蛋白進(jìn)行雙向電泳分析，獲得分離效果較好的差異蛋白表達(dá)圖譜。圖譜分析表明:差異蛋白穩(wěn)定表達(dá)，圖譜重復(fù)性較好，萌發(fā)過程中油體蛋白圖譜整體相關(guān)系數(shù)為0.706021;四張圖譜整體匹配出117個(gè)蛋白點(diǎn)，其中在0-24h、24-36h、36-48h之間