甘藍(lán)型冬油菜品種Tapidor春化前后全基因組組蛋白H3K27me3修飾變化及基因表達(dá)差異分析.pdf

1、油菜是世界上重要的油料作物，然而與水稻，擬南芥等傳統(tǒng)模式植物相比，有關(guān)油菜表觀遺傳學(xué)的研究還未見報(bào)道，因此研究油菜中表觀遺傳修飾具有重要意義。染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(ChIP)，是研究表觀遺傳學(xué)的重要手段，目前ChIP實(shí)驗(yàn)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種動(dòng)植物研究中，但是在油菜中，該技術(shù)具體方法尚未有明確的報(bào)道。
　　植物開花是植物生命周期中重要的生理轉(zhuǎn)換過程，低溫春化則是促進(jìn)冬性植物開花的重要條件。因此研究冬油菜開花的表觀遺傳調(diào)控機(jī)理，對(duì)于

2、進(jìn)一步了解春化促進(jìn)油菜開花過程的分子機(jī)理具有重要意義。本研究主要以春化處理前、后的甘藍(lán)型冬油菜品種Tapidor為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)ChIP實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行了探索;并利用H3K27me3抗體，結(jié)合ChIP-seq、RNA-seq和生物信息學(xué)分析等方法，對(duì)春化前、后Tapidor全基因組組蛋白H3K27me3修飾變化及差異表達(dá)基因進(jìn)行了分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1.以擬南芥、玉米、水稻等植物的ChIP實(shí)驗(yàn)為參考，調(diào)整了ChIP的實(shí)驗(yàn)流程和

3、具體參數(shù)。其中，我們確定了甲醛交聯(lián)時(shí)間為10min，超聲破碎條件為功率20％、時(shí)間30min、頻率為開2s/關(guān)9s，以及免疫沉淀處理等條件，并利用Real-timePCR進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果可用于后續(xù)ChIP-seq實(shí)驗(yàn)。
　　2.ChIP-seq分析結(jié)果表明測(cè)得序列標(biāo)簽mapping到參考基因組序列上的效率達(dá)到90％，但是unique reads只有25％左右。利用MACS1.4軟件檢測(cè)到Tapidor春化前有1607個(gè)peaks，

4、春化后則檢測(cè)到10662個(gè)peaks，說明與春化前相比，春化后的全基因組H3K27me3修飾大幅度上調(diào)。ChIPseeker軟件可視化則表明這些peaks主要分布在基因間隔區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)域，并且在TSS區(qū)域上的分布差異明顯。同時(shí)對(duì)所得到的peaks進(jìn)行基因注釋，注釋結(jié)果表明Tapidor春化前、后有H3K27me3修飾的基因數(shù)目分別為513和3146個(gè)，所含peaks分別占總peak數(shù)目的0.5％和3.1％，其中共同修飾的基因數(shù)目為245

5、個(gè)。春化前、后H3K27me3修飾基因的表達(dá)水平進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)分析說明了在甘藍(lán)型油菜中H3K27me3修飾對(duì)基因表達(dá)有抑制作用。
　　3.RNA-seq分析結(jié)果表明測(cè)得序列標(biāo)簽mapping到參考序列上的效率均大于90％，差異基因表達(dá)分析則表明與春化前相比，春化后共有6947個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因3382個(gè)，下調(diào)基因3565個(gè)。對(duì)差異基因的GO功能顯著性富集分析結(jié)果顯示差異基因主要集中在細(xì)胞器中，其中膜細(xì)胞器所占據(jù)的比例最大;分

6、子功能注釋后的表達(dá)差異基因主要與結(jié)合作用和酶活性有關(guān);生物過程中差異基因則主要集中在代謝途徑、抗逆途徑、刺激應(yīng)答、細(xì)胞組成以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑。KEGG Pathway顯著性富集分析表明差異基因主要富集在碳水化合物、脂肪、氨基酸的代謝，其次為能量代謝、生物合成中的次生代謝、外源因子降解，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及免疫系統(tǒng)等方面。
　　4.ChIP-seq與RNA-seq相結(jié)合對(duì)春化過程中基因的組蛋白H3K27me3修飾變化及表達(dá)差異分析表明:與春